2023年5月，由Kasper Karlsson為第一作者，Calvin J. Kuo1 和Christina Curtis為共通訊作者在《Nature》上發(fā)表了題為《Deterministic evolution and stringent selection during preneoplasia》的文章，利用強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)進(jìn)化平臺(tái)揭示了惡性腫瘤的上皮類(lèi)器官在早期的嚴(yán)格選擇、克隆干擾和顯著的表型趨同，強(qiáng)調(diào)了人源類(lèi)器官實(shí)驗(yàn)進(jìn)化的力量，以研究潛在的腫瘤前過(guò)程和體細(xì)胞進(jìn)化的可重復(fù)性，這對(duì)腫瘤發(fā)生的早期階段檢測(cè)和攔截侵襲性、基因組不穩(wěn)定的腫瘤具有重要意義。

胃癌（GC）是全球第四大癌癥死亡原因，缺乏常規(guī)篩查，其較長(zhǎng)的預(yù)診時(shí)間導(dǎo)致診斷晚、預(yù)后差和有限的治療選擇。因此，鑒別胃癌及其非特異性前體腸上皮化生的分子決定因素至關(guān)重要。癌癥產(chǎn)生于一個(gè)突變的細(xì)胞，在癌前克隆擴(kuò)增過(guò)程中積累額外的突變，這些突變?cè)诒硇驼５慕M織中擴(kuò)散，非整倍體和驅(qū)動(dòng)突變?cè)诎┌Y確診前逐年發(fā)展。其中TP53失活是胃癌中染色體不穩(wěn)定性（染色體拷貝數(shù)變異和染色體結(jié)構(gòu)異常）增強(qiáng)的早期事件。近幾年，實(shí)驗(yàn)進(jìn)化對(duì)微生物克隆動(dòng)力學(xué)的基本見(jiàn)解已經(jīng)形成，在人體衰老過(guò)程中，基因突變和優(yōu)勢(shì)選擇的力量推動(dòng)體細(xì)胞克隆擴(kuò)增，從而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生，利用類(lèi)器官的多細(xì)胞譜系特征來(lái)模擬這種突變進(jìn)化和克隆優(yōu)勢(shì)選擇該是一種完美的結(jié)合手段。

作者為了模擬胃癌中染色體不穩(wěn)定的發(fā)生，通過(guò)CRISPR-Cas9在正常胃類(lèi)器官中引入TP53雙等位基因移碼突變，導(dǎo)致基因產(chǎn)物失活，建立了分別從3個(gè)獨(dú)立供體（D）培養(yǎng)的共9個(gè)克隆衍生的TP53-/-培養(yǎng)物（C），進(jìn)行長(zhǎng)期繁殖，其中5個(gè)被分成3個(gè)重復(fù)(R)用于細(xì)胞條形碼研究（圖1a）。作者首先探索了TP53缺陷是否引起染色體數(shù)量和/或結(jié)構(gòu)染色體結(jié)構(gòu)異常。通過(guò)9種培養(yǎng)物的生長(zhǎng)不同階段進(jìn)行了測(cè)序，作者發(fā)現(xiàn)缺乏TP53的類(lèi)器官逐漸獲得染色體拷貝數(shù)量變異，野生型(WT)胃類(lèi)器官在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中并未出現(xiàn)染色體數(shù)量變異(圖1b)。而且來(lái)自同一供體的培養(yǎng)物表現(xiàn)出不同的染色體拷貝數(shù)變異模式，表明遺傳背景并不完全限制隨后的遺傳改變（圖1c）。在所有培養(yǎng)物中，基因組改變（FGA）的比例（非整倍體的量度）隨時(shí)間以不同的速率增加，并在600天左右達(dá)到穩(wěn)定（圖1d），D1C1積累了早期臂位改變，在260天表現(xiàn)出超過(guò)20%的FGA。在TP53-/-?胃癌類(lèi)器官中，染色體臂位和局灶CNAs的發(fā)生具有一定的時(shí)間優(yōu)先順序?(圖1e)。9號(hào)和3號(hào)染色體短臂的缺失在200天內(nèi)反復(fù)發(fā)生，表明這些改變對(duì)類(lèi)器官早期優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)特別有利。3號(hào)染色體短臂編碼的FHIT/FRA3B蛋白的缺失通常發(fā)生在TP53-/-胃類(lèi)器官的早期?；蚪M看護(hù)者FHIT基因在腫瘤進(jìn)展早期丟失，導(dǎo)致三磷酸脫氧胸腺嘧啶耗竭、復(fù)制應(yīng)激和DNA斷裂。CDKN2A和FHIT缺失在體外進(jìn)化和GCs中反復(fù)出現(xiàn)的早期缺失表明它們?cè)谀[瘤起始中起作用。其他CNAs包括18號(hào)和20號(hào)染色體長(zhǎng)臂的增加，都發(fā)生在較晚的時(shí)間，這種晚期的改變可能反映了胃癌類(lèi)器官對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)帶來(lái)的動(dòng)態(tài)選擇壓力，或者早期改變帶來(lái)的新的進(jìn)化路徑。這些數(shù)據(jù)表明，TP53的缺失促進(jìn)了胃細(xì)胞染色體非整倍性變化和組織特異性染色體拷貝數(shù)變異按特定順序的積累（圖1e）。

隨后，作者通過(guò)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)TP53-/-類(lèi)器官進(jìn)行了全基因組測(cè)序，證實(shí)了TP53-/-靶點(diǎn)失活，并顯示加權(quán)基因組不穩(wěn)定性指數(shù)增加，基因組雜合性損失增加，以及在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中染色體局部缺失和擴(kuò)增，單核苷酸變異和結(jié)構(gòu)變異也隨著時(shí)間的推移而增加(圖2a)。所有類(lèi)型的改變都在進(jìn)化的TP53-/-胃類(lèi)器官中積累，其中染色體結(jié)構(gòu)變異尤其顯著，在早期時(shí)間點(diǎn)以非聚集性和簡(jiǎn)單的聚集性重排為主，隨后是復(fù)雜的聚集性(十個(gè)或更多的重排)，隨著時(shí)間的推移，涉及到缺失、倒置和易位（圖2a）。D3C1在進(jìn)化過(guò)程中積累了多次染色體間重排（圖2b），這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異在在惡性Barrett食管中很常見(jiàn)，另外，TP53-/-胃類(lèi)器官的結(jié)構(gòu)變異負(fù)擔(dān)也顯著增加。另外，正如胃癌和Barrett食管所報(bào)道的那樣，F(xiàn)HIT基因座經(jīng)常包含復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，包括脆弱位點(diǎn)的缺口缺失 (圖2c)。

通過(guò)追蹤D3C1中FHIT重排的起源發(fā)現(xiàn)，包含這種重排的亞克隆丟失了（圖2d,e），一個(gè)具有明顯FHIT 缺口的獨(dú)立亞克隆（藍(lán)色）出現(xiàn)并持續(xù)存在，表明TP53-/-胃類(lèi)器官趨同進(jìn)化，因此，具有多個(gè)連接點(diǎn)的重排經(jīng)過(guò)細(xì)胞的多次進(jìn)化而形成的，而不是一個(gè)單一的事件。在其他類(lèi)器官中也發(fā)生了類(lèi)似的事件，包括3號(hào)和9號(hào)染色體易位。通過(guò)測(cè)定D3C1和D2C2在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的CNA譜的亞克隆群體，研究了克隆競(jìng)爭(zhēng)和滅絕。到第115天，D3C1獲得了許多缺失（9p，F(xiàn)HIT）和幾個(gè)結(jié)構(gòu)變異，包括持續(xù)的11號(hào)和14號(hào)染色體易位。超過(guò)600天，多個(gè)染色體拷貝數(shù)定義的亞克隆在滅絕前頻率增加（圖2d,e）。例如，4號(hào)染色體缺失和9號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增的亞克隆出現(xiàn)較早，在264天消失，被19號(hào)染色體短臂缺失的亞克隆取代，后者隨即獲得8號(hào)染色體短臂缺失，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂第二節(jié)擴(kuò)增以及16號(hào)染色體短臂的缺失這種改變，直到第404天保持優(yōu)勢(shì)，該亞克隆最終被18號(hào)和20號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失的亞克隆打敗，這兩種亞克隆都是反復(fù)發(fā)生的晚期事件。因此，一些突變克隆被固定并獲得統(tǒng)治地位，而另一些在滅絕之前達(dá)到相當(dāng)高的頻率，可能是由于克隆干擾，不同的染色體拷貝數(shù)變異亞克隆共存的時(shí)間較長(zhǎng)(約140天)，表明了相似的適應(yīng)度。這些數(shù)據(jù)表明上皮細(xì)胞群體在癌前病變過(guò)程中存在嚴(yán)格的選擇和普遍的克隆干擾。

根據(jù)TP53-/-胃類(lèi)器官的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和早、中、晚時(shí)間點(diǎn)的單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果(scRNA-seq)，作者評(píng)估體外進(jìn)化過(guò)程中的表型和轉(zhuǎn)錄變化（圖3a）。作者通過(guò)回歸模型擬合分析每代細(xì)胞數(shù)量來(lái)研究細(xì)胞增殖的變化，使用生長(zhǎng)導(dǎo)數(shù)和折疊變化作為適應(yīng)度的替代。與早期相比，在后期和中期時(shí)間點(diǎn)觀察到更高的生長(zhǎng)導(dǎo)數(shù)（圖3b）；使用原始細(xì)胞數(shù)得到了類(lèi)似的結(jié)果。對(duì)12個(gè)培養(yǎng)物進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到31,606個(gè)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量控制分析（圖3c）。

來(lái)自三個(gè)供體的WT胃類(lèi)器官中表達(dá)了正常胃組織標(biāo)記，包括D1中的窩粘膜細(xì)胞標(biāo)記（MUC5AC, TFF1, TFF2, GKN2），D2中的腸細(xì)胞標(biāo)記（FABP1, FABP2, ANPEP, PHGR1, KRT20）和D3中的腺體粘膜細(xì)胞標(biāo)記（MUC6, PGC, TFF2, LYZ），但在TP53-/-胃類(lèi)器官中是異質(zhì)性的（圖3c-e）。在WT培養(yǎng)中，由粘蛋白和TFF基因表達(dá)定義的粘膜樣表型在D1和D3中隨著TP53雙等位基因敲除而消失。在D1中，腸杯狀細(xì)胞特異性標(biāo)志物（TFF3、WFDC2、MUC5B）在晚時(shí)間點(diǎn)上調(diào)，這在腸化生中很常見(jiàn)。胃癌相關(guān)基因CLDN3、CLDN4、CLDN7和癌胚抗原家族基因（CEACAM5、CEACAM6）在D1和D3中的表達(dá)隨時(shí)間增加。作者利用scRNA-seq數(shù)據(jù)，通過(guò)交叉分析研究6種培養(yǎng)物早期到晚期的顯著差異表達(dá)基因，研究了TP53-/-胃類(lèi)器官轉(zhuǎn)錄特征的重疊，共鑒定出13個(gè)持續(xù)上調(diào)的與胃癌相關(guān)的基因（CLDN4、TM4SF1、ZFAS1）和40個(gè)持續(xù)下調(diào)的基因（SPTBN1、LYZ、TFF2）（圖3e）。

為了確定TP53-/-胃類(lèi)器官的病理特征，作者首先繪制了胃正常細(xì)胞和胃腫瘤細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)圖，利用文獻(xiàn)來(lái)源的標(biāo)記基因?qū)⒋x的6,001個(gè)上皮細(xì)胞分配到不同的細(xì)胞類(lèi)型簇，并且出現(xiàn)了兩個(gè)包括粘膜樣惡性細(xì)胞（MUC5AC, TFF2, TFF1）和非粘膜樣惡性細(xì)胞（KRT17, KRT7, LY6D）腫瘤細(xì)胞簇（圖4a），此外，PMCs、GMCs、主細(xì)胞、壁細(xì)胞、腸細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和增殖細(xì)胞也被劃分為集群（圖4b）。接下來(lái)，作者將TP53-/-胃類(lèi)器官早期、中期和晚期時(shí)間點(diǎn)的scRNA-seq數(shù)據(jù)分別投影到參考數(shù)據(jù)圖上，以識(shí)別最相似的胃細(xì)胞類(lèi)型（圖4c）。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞狀態(tài)的變化在所有培養(yǎng)物中都很明顯，其中一些與胃炎的轉(zhuǎn)變有關(guān)，這種轉(zhuǎn)變可能導(dǎo)致腸道化生并最終導(dǎo)致惡性腫瘤（圖4d）。

通過(guò)最近鄰法鑒定參考群體，胃類(lèi)器官的細(xì)胞類(lèi)型頻率的變化被量化（圖4e）。結(jié)果顯示有3個(gè)在后期時(shí)間點(diǎn)觀察到粘膜樣惡性細(xì)胞的增加（D3C2、D3C3和D1C1）。相比之下， D2粘膜樣惡性細(xì)胞減少，而非粘膜樣惡性細(xì)胞增加(D2C2、D2C3)（圖4e），解釋了相對(duì)于D1和D3的轉(zhuǎn)錄差異（圖3）。值得注意的是，D2WT中約30%的細(xì)胞在腸細(xì)胞附近投影，可能導(dǎo)致胃炎樣特征，并強(qiáng)調(diào)腸細(xì)胞和惡性細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性。D1和D3的WT培養(yǎng)主要表現(xiàn)為粘膜表型。粘膜基因表達(dá)的減少表明，TP53-/-胃類(lèi)器官在進(jìn)化過(guò)程中正在向腸化生和惡性腫瘤發(fā)展，這證實(shí)了基于特定標(biāo)記基因來(lái)監(jiān)督分析組織病變的可靠性。

作者利用細(xì)胞條形碼標(biāo)記每個(gè)TP53-/-胃類(lèi)器官細(xì)胞，通過(guò)高復(fù)雜性細(xì)胞條形碼的前瞻性譜系追蹤，在細(xì)胞分辨率上來(lái)表征腫瘤發(fā)生前的亞克隆動(dòng)力學(xué)。作者選擇了5個(gè)TP53-/-克隆和1個(gè)TP53-/-+APC-/-克隆在初始階段被ECB慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，每個(gè)ECB親本系被分成三個(gè)重復(fù)，以評(píng)估克隆動(dòng)力學(xué)的可重復(fù)性。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)所有培養(yǎng)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，以驗(yàn)證TP53/APC缺失的克隆性。作者通過(guò)假設(shè)同一亞克隆的生長(zhǎng)反映了內(nèi)在的適應(yīng)度優(yōu)勢(shì)，反映不同的亞克隆優(yōu)勢(shì)表明其獲得的適應(yīng)度差異（圖5a）。在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，ECB標(biāo)記的類(lèi)器官克隆的縱向進(jìn)化中的淺基因組測(cè)序結(jié)果在整體基因組水平上表現(xiàn)出顯著的可重復(fù)性，重復(fù)培養(yǎng)物之間具有非常高的相似性CNAs（圖5b）。在D2C2中，在所有三個(gè)重復(fù)中，新的CNAs在258天左右出現(xiàn)；在D2C1中，R2的亞克隆8號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增在第258天檢測(cè)到并持續(xù)存在?？傮w來(lái)說(shuō)，相較于重復(fù)培養(yǎng)之間的差異（R1/R2/R3），來(lái)自同一供體的不同培養(yǎng)的CNAs變化更大（D2C1/D2C2）（圖5b）。

通過(guò)定期對(duì)ECB標(biāo)記的類(lèi)器官克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，作者評(píng)估了亞克隆隨時(shí)間出現(xiàn)的相對(duì)豐度 (圖5c)。根據(jù)培養(yǎng)物中重復(fù)的亞克隆頻率為條形碼分配顏色，頻率最高的亞克隆為紅色。D2C1R1中的紅色帶表示與D2C1R2和D2C1R3中相同的條形碼子克隆，紅色亞克隆在所有重復(fù)中都成為優(yōu)勢(shì)（圖5c），這與內(nèi)在適應(yīng)度優(yōu)勢(shì)和確定性生長(zhǎng)一致（圖5a）。對(duì)于D2C1的重復(fù)培養(yǎng)物R1和R3，紅色亞克隆成為優(yōu)勢(shì)，而在R2中，獲得8號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增的綠色亞克隆超過(guò)了群體；棕色和綠色的克隆在滅絕之前是同步擴(kuò)張的，這表明它們是相互依賴(lài)的?？缰貜?fù)的亞克隆頻率隨時(shí)間的相關(guān)性很高，反映了培養(yǎng)中相似的亞克隆動(dòng)態(tài)和跨培養(yǎng)的相似模式。通過(guò)構(gòu)建亞克隆特異性生長(zhǎng)曲線及對(duì)其衍生物的評(píng)估，作者發(fā)現(xiàn)“獲勝”亞克隆具有高初始適應(yīng)度，并且隨著時(shí)間的推移增殖能力增加（圖5d）。因此，譜系追蹤顯示了在重復(fù)培養(yǎng)中可復(fù)制的動(dòng)態(tài)，適應(yīng)性譜系在ECB轉(zhuǎn)導(dǎo)后144天迅速進(jìn)入固定狀態(tài)，優(yōu)勢(shì)克隆占據(jù)種群主要群體。這些優(yōu)勢(shì)群體的克隆模式與同基因型微生物種群在初始變化過(guò)程中快速適應(yīng)繁殖模式有著異曲同工之妙。

綜上所述，作者通過(guò)基因編輯模擬了腫瘤發(fā)生前其基因型進(jìn)化和表型之間的關(guān)系，這里作者利用TP53缺失概括胃癌染色體不穩(wěn)定性的多個(gè)特征，強(qiáng)調(diào)了腫瘤發(fā)生前進(jìn)化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)在過(guò)程的重要性。這些在類(lèi)器官應(yīng)用上的開(kāi)創(chuàng)性研究結(jié)果不但推動(dòng)人類(lèi)細(xì)胞突變、選擇和基因組不穩(wěn)定性的實(shí)證和理論研究，更進(jìn)一步奠定類(lèi)器官技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的地位。