環(huán)狀RNA（circRNA）由一種非經(jīng)典剪接方式——反向剪接產(chǎn)生，反向剪接位點（BSJ）連接首尾兩端成環(huán)，與其對應(yīng)的線性mRNA區(qū)分開來。在免疫信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和病毒感染期間，circRNA表達(dá)模式會發(fā)生改變，但其在免疫功能和病毒感染中的調(diào)節(jié)作用卻鮮為人知。目前，circRNA在HIV-1復(fù)制中的分子作用機制仍然是一大未解之謎。

牛津納米孔技術(shù)（ONT）測序平臺可以實現(xiàn)直接RNA測序（DRS），但目前僅用于捕獲聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本。因此，長讀長測序技術(shù)僅應(yīng)用于來自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的circRNA，而逆轉(zhuǎn)過程的反向剪接和外顯子重復(fù)會給circRNA表達(dá)分析帶來復(fù)雜性[1]。在病毒感染的背景下，病毒轉(zhuǎn)錄本的豐度、融合轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生以及RNA代謝的整體失調(diào)可能會掩蓋由宿主編碼的且豐度較低的RNA，使這類RNA的作用和意義被忽視。所以，探索檢測病毒感染期間低豐度RNA（例如circRNA）的新方法十分有必要，為研究病毒感染機制提供新思路。

2023年9月6日，印度科學(xué)教育研究所（IISER）生物科學(xué)系分子病毒學(xué)實驗室Ajit Chande博士在Science Advances(IF=13.6)發(fā)表文章“HIV-1 Vpr induces ciTRAN to prevent transcriptional repression of the provirus”。作者使用Nanopore測序平臺實現(xiàn)DRS，從HIV-1感染的T細(xì)胞中捕獲circRNA并鑒定了一種調(diào)節(jié)HIV-1轉(zhuǎn)錄的circRNA——ciTRAN。研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染會誘導(dǎo)ciTRAN以Vpr依賴方式進(jìn)行表達(dá)，且ciTRAN與SRSF1相互作用。HIV-1通過ciTRAN從病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中剔除SRSF1，從而促進(jìn)病毒的有效轉(zhuǎn)錄。綜上表明，宿主circRNA表達(dá)對HIV-1復(fù)制的影響是靈長類慢病毒克服傳播瓶頸的潛在因素。

直接RNA納米孔測序檢測病毒感染誘導(dǎo)的circRNA

首先，作者通過迭代耗盡線性RNA來去除非circRNA，以富集circRNA至50-86倍，再將poly-A尾巴添加到富集的circRNA中，從而實現(xiàn)DRS。納米孔DRS不僅能獲得circRNA的全長序列，還可以同時檢測m6A修飾，以此預(yù)測除了IRES外的蛋白質(zhì)編碼circRNA。此外，作者將circDR-seq與CIRI-long和circNICK-LRS進(jìn)行了比較，證明circDR-seq檢測到的circRNA數(shù)量相當(dāng)可觀，以天然形式檢測到1017個circRNA（其中對照組有831個，病毒感染組有186個），并且還評估了其同時捕獲RNA修飾和具備編碼潛力的可能性。

ciTRAN緩解病毒基因表達(dá)的整合后阻滯，影響病毒感染性

作者篩選出10種在感染細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)的circRNA，并運用CRISPR-CasRx技術(shù)在T細(xì)胞中對其進(jìn)行敲除。實驗發(fā)現(xiàn)，敲除ciRAN（circSMARCA5）后的細(xì)胞在感染HIV-1時其病毒編碼的熒光素酶的表達(dá)量明顯下降，而同源的線性RNA及其蛋白水平在該條件下不受影響。接著，作者從感染細(xì)胞中收集亞細(xì)胞組分來確定ciTRAN靶向的病毒生命周期階段，發(fā)現(xiàn)敲降ciTRAN對逆轉(zhuǎn)錄的HIV cDNA的數(shù)量沒有變化，整合的前病毒數(shù)量也沒有變化，而細(xì)胞質(zhì)中病毒mRNA表達(dá)水平減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)病毒Gag積累減少。以上表明，ciTRAN耗竭會抑制病毒感染性，對病毒基因表達(dá)并整合到宿主基因組的過程有影響。

ciTRAN與HIV轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)因子結(jié)合

作者運用CARPID和質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SRSF1是ciTRAN的最佳互作分子；通過PAR-CLIP檢測與SRSF1互作的circRNA，發(fā)現(xiàn)ciTRAN的富集倍數(shù)最高，表明ciTRAN可能通過與宿主蛋白SRSF1的相互作用來調(diào)節(jié)HIV-1轉(zhuǎn)錄。接著，評估SRSF1對JTAg靶細(xì)胞HIV-1感染性的影響發(fā)現(xiàn)，SRSF1異位表達(dá)引起的表型和敲除ciTRAN的作用效果一致。通過GFP熒光蛋白測定病毒對細(xì)胞感染性，發(fā)現(xiàn)SRSF1表達(dá)減少會使子代病毒粒子的數(shù)量也相應(yīng)地減少，表明SRSF1在病毒生物發(fā)生和隨后的子代病毒粒子感染性期間存在影響。綜上說明，ciTRAN與HIV-1感染性的負(fù)調(diào)節(jié)因子SRSF1具有相互作用。

ciTRAN通過阻斷SRSF1以促進(jìn)病毒感染性

作者進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，發(fā)現(xiàn)敲降ciTRAN增強了SRSF1與TAR位點的相互作用，這種互作可以將Pol-II從病毒啟動子中剔除，表明ciTRAN通過阻斷SRSF1來促進(jìn)病毒啟動子的主動轉(zhuǎn)錄。接著，作者運用PAR-CLIP技術(shù)評估多個SRSF1片段缺失突變體與ciTRAN的相互作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)SRSF2的RRM1區(qū)域被刪除時，ciTRAN不再有任何富集，而且ciTRAN和ΔRRM2突變體之間喪失相互作用，病毒感染性增加。

作者通過細(xì)胞穿膜肽（CPP）融合的RRM2-HA檢測特定SRSF1蛋白結(jié)構(gòu)域的作用，證明了SRSF1-RRM2與TAR基因座和ciTRAN的結(jié)合作用，并因此抑制病毒復(fù)制，而SRSF1-RRM1無該作用。綜上表明，SRSF1的RRM2區(qū)域識別ciTRAN并與之互作，以抑制病毒復(fù)制。

HIV-1 Vpr誘導(dǎo)ciTRAN表達(dá)

作者使用RT-qPCR對健康供體和艾滋病毒感染者的全血檢測ciTRAN水平，發(fā)現(xiàn)自然感染的平均ciTRAN誘導(dǎo)率為5.6倍，而病毒誘導(dǎo)ciTRAN的表達(dá)水平高達(dá)10倍。而且，只有HIV-1病毒能誘導(dǎo)ciTRAN上調(diào)，小鼠白血病病毒MLV則誘導(dǎo)無效。通過RT-qPCR檢測缺乏特定病毒基因?qū)iTRAN表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)ciTRAN水平在病毒缺乏Vpr時明顯降低，而在其他條件下幾乎沒有變化；在原代CD4細(xì)胞中重復(fù)該實驗，進(jìn)一步證實了病毒編碼的Vpr蛋白對ciTRAN的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用。

Vpr對ciTRAN的誘導(dǎo)作用具有保守性

作者分別轉(zhuǎn)染了NL4-3、CH040和REJO病毒中編碼代表性Vpr等位基因的pCDNA后，發(fā)現(xiàn)均能顯著誘導(dǎo)ciTRAN表達(dá)，而來自HIV-2的Vpx卻不能誘導(dǎo)ciTRAN表達(dá)。此外，Vpr誘導(dǎo)ciTRAN有助于增強感染性，還可以增強巨噬細(xì)胞中的病毒復(fù)制。病毒粒子包裝的Vpr也可以誘導(dǎo)ciTRAN表達(dá)，且呈劑量依賴性。這些結(jié)果表明，HIV-1 Vpr是誘導(dǎo)ciTRAN表達(dá)所必需的。

Ajit Chande博士

“我們的研究結(jié)果表明，HIV-1病毒劫持了這種宿主編碼的ciTRAN，使其能夠有效地繁殖。這一發(fā)現(xiàn)揭示了HIV-1等病毒如何克服傳播障礙的未知方面?！?/p>

IISER Bhopal主任Gobardhan Das教授

“這項工作開辟了新的研究領(lǐng)域，可能為宿主導(dǎo)向治療提供新的線索。”

這項研究的另一個重要結(jié)果是，研究人員開發(fā)了一種小分子蛋白，可以在病毒誘導(dǎo)的ciTRAN中抑制病毒轉(zhuǎn)錄。通過展示ciTRAN如何促進(jìn)病毒有效繁殖的能力，這項研究為開發(fā)新的治療干預(yù)措施提供了有希望的途徑。此外，能夠抑制病毒轉(zhuǎn)錄的分子的產(chǎn)生，代表了我們對抗HIV-1和潛在的其他病毒的理解的重大飛躍。

小結(jié)：

本文為我們提供了一種納米孔測序檢測環(huán)狀RNA的新策略，使用特定算法實現(xiàn)對長測序片段中的circRNA序列進(jìn)行識別和全長重構(gòu)，進(jìn)而解析circRNA的功能作用。更多策略可以參考之前的文章：環(huán)狀RNA十周年丨測序技術(shù)篇

原文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh9170

參考文獻(xiàn)：

[1] J. Zhang, L. Hou, Z. Zuo, et al., Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Nat. Biotechnol. 39, 836–845 (2021).