去年10.28的文章，關(guān)注VSMC的表型轉(zhuǎn)換

作者關(guān)注到的現(xiàn)象：VSMC的表型轉(zhuǎn)換過程中，線粒體氧化磷酸化會逐漸變?yōu)橛醒跆墙徒狻?/p>

然而，VSMC調(diào)節(jié)這二者之間平衡以維持收縮表型的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑仍不清楚。

PHB2是參與多種細胞功能的多效支架蛋白，廣泛表達在核、質(zhì)、線粒體中。

Result1：rna序列分析預(yù)測將能量穩(wěn)態(tài)與VSMCs收縮表型聯(lián)系起來的新的候選基因

VSMC的兩種表型：收縮型和分泌型。TGF-B能使VSMC向收縮型轉(zhuǎn)換，PDGF使其向分泌型轉(zhuǎn)換。因此用TGF和PDGF分別處理VSMC，前者上調(diào)而后者下調(diào)的基因是維持收縮表型的基因。有6個。其中變化最明顯的是PHB2。

siRNA敲低PHB2，觀察到VSMC收縮表型標(biāo)志基因下調(diào)。進一步提示PHB2可能參與收縮表型的維持。

PHB2定位于中膜層? ? ? ? /////怎么看出來的？

Result2：PHB2減少與VSMCs轉(zhuǎn)分化相關(guān)

用WB進一步驗證。此外使用血清饑餓條件誘導(dǎo)收縮表型，PHB2表達上升。

大鼠頸動脈球囊損傷后3、7和14天，PHB2的表達明顯降低，VSMCs收縮標(biāo)記物減少，新生內(nèi)膜面積增加。頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的動脈中PHB2的表達較對照組乳腺內(nèi)動脈明顯降低。

前兩個results好奇怪qwq，第一個體外測mRNA，第二個測蛋白+血清模型+體內(nèi)，另外做了隨時間表達。難道是簡單篩選——進一步驗證？

Result3：PHB2在體外維持VSMC的收縮表型

siRNA敲低PHB2，收縮標(biāo)志基因表達下調(diào)。并且可以逆轉(zhuǎn)TGF-B造成的向收縮表型轉(zhuǎn)變。

敲除PHB2，收縮基因表達下調(diào)。

VSMC從細長形的收縮態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅蔚姆置趹B(tài)

一些評估收縮性的指標(biāo)（凝膠收縮實驗、對苯腎上腺素的反應(yīng)性）

一些評估遷移能力的指標(biāo)（劃痕實驗、Boyden實驗）

偏個題介紹一下Boyden實驗。感覺就是transwell

上層細胞在下層趨化試劑的作用下遷移下去

這一部分，還是在驗證PHB2對維持VSMC收縮表型很重要

Result4：在體內(nèi)PHB2缺乏可加速損傷后新生內(nèi)膜形成

VSMC特異性敲除PHB2的小鼠，收縮表型的標(biāo)志減少

而細胞增殖活性增加（BrdU評估細胞增殖）

新生內(nèi)膜面積增加

這一部分就是在體內(nèi)的驗證

Result5：hnRNPA1是PHB2的新型結(jié)合蛋白

在大鼠原代VSMC中探索PHB2的結(jié)合蛋白。用PHB2抗體處理，做液相色譜分析，由此檢測出了一些結(jié)合蛋白。其中hnRNPA1排第一

hnRNPA1是一種在多種生物過程中具有重要作用的蛋白。一項近期研究表明，hnRNPA1在損傷后內(nèi)膜生成中調(diào)節(jié)VSMC增殖和代謝中具有重要作用。

要驗證兩種蛋白之間具有相互作用——先看看是否調(diào)節(jié)其基因表達——敲低一個，看看另一個的表達量是否變化——然后看二者是否直接結(jié)合——IP——分區(qū)域IP

在核、質(zhì)中分別進行IP，在核中結(jié)合，而在質(zhì)中不結(jié)合

表達出各種突變體，得到了二者的結(jié)合域

結(jié)論：PHB2的C端與hnRNPA1的RGG-box結(jié)構(gòu)域結(jié)合

Result6：hnRNPA1-PHB2相互作用在體內(nèi)和體外對于維持VSMC收縮表型是必要的

單克隆hnRNPA1的RGG域和M9C端。M9能使hnRNPA1出核，以此阻斷核內(nèi)hnRNPA1與PHB2的結(jié)合。

這樣做的結(jié)果是抑制了收縮基因的轉(zhuǎn)錄、細胞遷移性增加

體內(nèi)實驗：球囊損傷后第七天，收縮基因表達增加

內(nèi)膜增厚

這部分說明了PHB2與hnRNPA1結(jié)合的重要性

但要是沒有M9怎么辦呢

Result7：PHB2抑制hnRNPA1介導(dǎo)的prePKM mRNA剪接、PKM2表達和有氧糖酵解

hnRNPA1是已知的prePKM mRNA的調(diào)節(jié)蛋白，PKM2是糖酵解的最終限速步，PKM1促進氧化磷酸化，二者來源于mRNA的不同剪接。PKM2表達增加可促進動脈粥樣硬化，而缺失PKM2能抑制損傷后內(nèi)膜生成。因此這部分研究了PHB2是否影響hnRNPA1介導(dǎo)的mRNA剪接，以及所造成的PKM表達量改變、代謝改變。

用PstI和NcoI酶切擴增子后進一步進行RTPCR，結(jié)果顯示Phb2缺乏促進了PKM1向PKM2的反式表達

敲除PHB2也能促進PKM1向PKM2轉(zhuǎn)化

抑制結(jié)合之后也是

糖酵解增強，氧化磷酸化降低

PDGF刺激的VSMC中，PHB2抑制的轉(zhuǎn)分化被過表達PKM2消除

VSMC特異性PKM2敲低能夠抑制新生內(nèi)膜形成

總結(jié)一下：在正常的VSMC中，PHB2結(jié)合hnRNPA1，抑制hnRNPA對pre-PKM mRNA的剪接，此時生成PKM1，促進氧化磷酸化，維持VSMC收縮表型。病理條件下hnRNPA1剪接pre-PKM mRNA，生成PKM2，促進糖酵解，使VSMC轉(zhuǎn)化為分泌型。

Discussion

1. PHB2能調(diào)節(jié)代謝重編程
   

2. PHB2不調(diào)節(jié)hnRNPA1的表達水平

3. mi-124？

磨磨蹭蹭終于讀完了