RNA與蛋白質(zhì)的相互作用是細胞生理過程得以實現(xiàn)的決定性因素之一。

近年來，隨著技術(shù)的改進和新方法的建立，RNA和蛋白質(zhì)的相互作用研究取得了長足進步。目前科研人員已經(jīng)鑒定了較多RNA上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，也發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)中的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并對它們的結(jié)構(gòu)特征進行了比較詳細的研究。

這些為最終探明RNA和蛋白質(zhì)相互作用的分子機制，從而從本質(zhì)上認識相關(guān)的細胞生理過程打下實的基礎(chǔ)。

一．RNA pull down 技術(shù)應(yīng)用

1.? 癌癥腫瘤相關(guān)調(diào)控機制研究

LncRNA發(fā)揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，主要包括基因組表觀遺傳修飾、調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯、發(fā)揮ceRNA、增強子RNA作用等，從而對細胞增值、分化、遷移、凋亡、免疫等發(fā)揮調(diào)控作用。

lncRNA能夠通過對腫瘤細胞糖代謝、谷氨酰胺代謝和脂類代謝途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤細胞對葡萄糖攝取增加，谷氨酰胺分解增強以及脫質(zhì)生成增加，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，大多數(shù)lncRNA在腫瘤細胞能量代謝中的功能和調(diào)控機制尚不完全清楚，進一步認識和了解細胞中與lncRNA相關(guān)的能量代謝異常表現(xiàn)出的惡性生物學(xué)行為，將有助于為腫瘤的診斷和治療提供有效的證據(jù)以及新的思路和途徑。

環(huán)狀RNA(cicular RNA,cicRNA)是近來研究很熱門的一種特殊的長鏈非編碼RNA。研究發(fā)展，circRNA在人體細胞中廣泛表達，在轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控基因表達的重要功能，并且參與多種腫瘤和其他疾病的病理發(fā)展過程。

circRNA大多數(shù)是由外顯子序列組成。呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，高度保守，通過微小RNA"海綿"作用調(diào)控靶基因表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這些特性使circRNA有潛力成為腫瘤新型分子診斷標志物。通過競爭性與腫瘤相關(guān)的微小RNA的結(jié)合，可以開發(fā)針對circRNA分子的靶點的靶向治療。因為circRNA在腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究中意義更大。?

2.? 多種人類疾病研究

RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，LncRNA活性、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生發(fā)展、細胞凋亡等眾多生物學(xué)過程，且與諸多人類疾病密切相關(guān)。因此，對RBPs–RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究和鑒定意義。但由于RBPs作用方式復(fù)雜，功能多樣性，作用空間位置多樣化等原因，對其開展精確的研究一直是一個重大挑戰(zhàn)。RNA領(lǐng)域，尤其是非編碼RNA研究的快速發(fā)展，催生了多種RBPs–RNAs互相作用鑒定技術(shù)。

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二．RNA pull down實驗內(nèi)容

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使用體外轉(zhuǎn)錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。

蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細胞發(fā)育調(diào)控等。若待檢測目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜進行鑒定。

實驗流程：

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1.? 構(gòu)建RNA過表達質(zhì)粒：基因合成+測序驗證

2.? 體外轉(zhuǎn)錄模板準備：設(shè)計含T7啟動子引物；PCR擴增得到轉(zhuǎn)錄模板。

3.? 體外轉(zhuǎn)錄：以PCR產(chǎn)物為模板，體外轉(zhuǎn)錄得到目的RNA

4.? RNA pull down：通過磁珠-RNA探針復(fù)合物富集互作的蛋白

5.? 銀染質(zhì)檢：SDS-PAGE電泳銀染檢測富集蛋白的情況

6.? 質(zhì)譜鑒定：通過質(zhì)譜鑒定實驗組與對照組的差異蛋白；進而篩選可能的互作蛋白。

相關(guān)實例圖：A:以構(gòu)建過表達質(zhì)粒為模板+設(shè)計合成好的引物，擴增得到體外轉(zhuǎn)錄模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增PCR產(chǎn)物情況，切取目的條件純化回收備用。

B:根據(jù)銀染結(jié)果來選擇質(zhì)譜鑒定的方式：RNA pull-down設(shè)置實驗組及反義鏈對照組，銀染找出差異條帶進行膠條質(zhì)譜鑒定。

1.存在肉眼可見差異條帶

2.無肉眼可見差異條帶

3.存在濃度差異條帶

注：1：切取sense實驗組泳道中的差異條帶進行膠條鑒定。2：將sense實驗組和antisense對照組兩組蛋白液進行全譜鑒定，根據(jù)鑒定分析結(jié)果找出sense實驗組中特有的蛋白，進行篩選與自己研究相關(guān)的蛋白進行后續(xù)驗證。3:也將sense實驗組和antisense對照組兩組蛋白液分別進行全譜鑒定，根據(jù)鑒定分析結(jié)果找出sense實驗組中特有的蛋白，進而篩選與自己研究相關(guān)的蛋白進行后續(xù)驗證。

三．甲方提供

RNA序列或者RNA序列構(gòu)建的質(zhì)粒（種屬）

相同種屬的細胞樣品

目的基因種屬及ID號

樣本數(shù)量

分析要求

四．最終交付

基因合成測序報告

構(gòu)建含目的基因的質(zhì)粒、菌液，測序報告

體外轉(zhuǎn)錄模版的sense&antisense引物、模版電泳圖

RNA Pull-down蛋白SDS-PAGE銀染

質(zhì)譜鑒定報告

原始數(shù)據(jù)以及完整性實驗報告

五.結(jié)果實例

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