上一期內(nèi)容為大家介紹了非編碼RNA調(diào)控概述?，本期將從LncRNA的簡介分類、功能、常用數(shù)據(jù)庫、研究思路及功能調(diào)控等為大家詳細(xì)介紹非編碼RNA調(diào)控系列之LncRNA的調(diào)控。

LncRNA的簡介及分類

? ? 1.LncRNA的簡介

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, LncRNA），一般指基因長度大于200nt的長鏈非編碼RNA的統(tǒng)稱。LncRNA主要是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，最早被認(rèn)為基因組轉(zhuǎn)錄中的“噪音”片段，因此被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能。然而近年研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA是真核生物生命活動的重要組成部分[1]。LncRNA在1991年首次被證實(shí)參與X染色體沉默，隨后被證實(shí)具有染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、ceRNA調(diào)控等多種調(diào)控過程，LncRNA的調(diào)控作用也開始成為近年來研究的熱點(diǎn)。

2.LncRNA的分類

LncRNAs一般可根據(jù)其自身結(jié)構(gòu)、定位、功能或與DNA/RNA/蛋白互作功能進(jìn)行分類。我們今天主要介紹通過其相對于附近蛋白質(zhì)編碼基因的基因組位置[2]，LncRNAs可分為：

1) 正義LncRNAs：與鄰近蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄方向相同，與編碼基因的一個/多個外顯子重疊；

2) 反義LncRNAs：與鄰近蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄方向相反，與相反鏈上的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物部分或完全互補(bǔ)；

3) 內(nèi)含子LncRNAs：來源于編碼基因的內(nèi)含子，由基因的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；

4) 基因間LncRNAs：由編碼基因之間的序列獨(dú)立轉(zhuǎn)錄；

5) 雙向LncRNAs：可同時從與鄰近蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄方向相同和相反2個方向發(fā)生轉(zhuǎn)錄；

6) 增強(qiáng)子LncRNAs：由蛋白質(zhì)編碼基因的增強(qiáng)子區(qū)域產(chǎn)生。

圖1. LncRNA基因組位置分類[3]

LncRNA的相關(guān)功能介紹

LncRNA不只是基因組中的承接序列，更多是承擔(dān)了各種DNA、RNA及蛋白間調(diào)控功能的重要遺傳信息。LncRNA發(fā)揮功能主要依靠其二級結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)結(jié)合，可引起染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄功能調(diào)控等。還可以通過ceRNA競爭機(jī)制，與靶基因mRNA競爭性結(jié)合miRNA，間接影響靶基因表達(dá)量。也可以通過與編碼蛋白基因的mRNA形成互補(bǔ)鏈，影響其剪切或翻譯結(jié)果。因此LncRNA的生物學(xué)功能明確了許多基因組復(fù)雜性表達(dá)調(diào)控的難題，接下來我們詳細(xì)的探索下LncRNA的主要功能：

圖2. LncRNA基因功能[3]

1.LncRNA表觀遺傳學(xué)調(diào)控1）LncRNA可以通過RNA-DNA或RNA-染色質(zhì)相互作用，發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控功能。

2）LncRNA可以是染色質(zhì)重塑蛋白打開或關(guān)閉染色質(zhì)的支架。LncRNA通過共價修飾途徑直接與組蛋白或DNA修飾酶相互作用；也可以通過非共價調(diào)控，依賴ATP調(diào)控染色質(zhì)重塑。

2.LncRNA轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控

1）LncRNA可以通過順式/反式調(diào)節(jié)影響成熟mRNA的穩(wěn)定性、差異剪接、修飾的編輯等。

2）LncRNA可以通過在翻譯過程中與核糖體或mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA的翻譯。

3）LncRNA可以是轉(zhuǎn)錄因子激活/抑制的支架，其與轉(zhuǎn)錄因子的作用調(diào)控主要體現(xiàn)在LncRNA與蛋白的互作。由于LncRNA較長，確定LncRNA的作用區(qū)域是研究LncRNA-蛋白互作機(jī)制的關(guān)鍵步驟。

3.ceRNA機(jī)制調(diào)控LncRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合miRNA種子區(qū)域序列競爭性地吸附miRNA，從而阻斷miRNA與下游靶基因的結(jié)合，進(jìn)而影響下游靶基因表達(dá)量的變化。作為競爭性內(nèi)源性RNA，LncRNA可以導(dǎo)致miRNA功能的喪失或降低，并影響miRNA對靶基因的調(diào)控作用。

4.LncRNA編碼蛋白LncRNA一般被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄本中缺少開放閱讀框，不能被翻譯成蛋白質(zhì)。但2011年，發(fā)表在?《Cell 》上的文章表明LncRNA可以被核糖體吸引，并通過檢測翻譯效率相關(guān)的數(shù)值，證明了其中一些LncRNA具有翻譯產(chǎn)生小肽的能力[4]。在2020年的一篇研究中，研究團(tuán)隊使用了眾多的宏觀組學(xué)的分析，包括ribosome profiling、mass spectrometry (MS)-based proteomics、microscopy以及 CRISPR-based genetic screening等方法[5]，證明了在人類的細(xì)胞中數(shù)百個LncRNA能表達(dá)出穩(wěn)定的微肽，并參與細(xì)胞的生命活動。研究揭示了編碼微肽與功能性調(diào)控RNA均可作為LncRNA的功能，發(fā)揮作用并不沖突。

LncRNA常用數(shù)據(jù)庫

了解LncRNA功能后，我們應(yīng)該通過強(qiáng)大復(fù)雜的LncRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)信息或相關(guān)預(yù)測的查詢，下面是一些LncRNA研究常用的數(shù)據(jù)庫匯總，可以對應(yīng)查詢到LncRNA的基因信息、亞細(xì)胞定位、SNP位點(diǎn)、編碼能力及相關(guān)疾病等（表1）。

LncRNA的研究方案

熟悉了LncRNA的相關(guān)功能和常用數(shù)據(jù)庫后，就可以針對LncRNA展開具體的實(shí)驗(yàn)研究。LncRNA的研究思路主要分為三大部分：LncRNA靶點(diǎn)篩選、LncRNA功能研究以及LncRNA相關(guān)的機(jī)制研究，下面我們針對LncRNA的研究方案進(jìn)行具體說明。

圖3. LncRNA研究思路導(dǎo)圖

1.LncRNA靶點(diǎn)篩選LncRNA靶點(diǎn)篩選需要先通過生物信息學(xué)分析、RNA-seq以及芯片技術(shù)等對疾病模型/病例樣本進(jìn)行LncRNA表達(dá)譜分析，用來發(fā)現(xiàn)和篩選差異性表達(dá)的LncRNA，并在疾病模型組織中進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。由于LncRNA核定位概率較高，因此功能研究前建議確認(rèn)LncRNA的亞細(xì)胞定位。

1）LncRNA發(fā)現(xiàn)與篩選

LncRNA篩選主要通過高通量LncRNA芯片、直接測序或生物信息學(xué)分析方法篩選差異表達(dá)的LncRNA，也可以通過生物信息學(xué)預(yù)測共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)的LncRNA靶點(diǎn)，進(jìn)而確認(rèn)其上下游及關(guān)聯(lián)基因。

2）LncRNA差異表達(dá)驗(yàn)證

通過QPCR方法檢測相關(guān)疾病模型組織或細(xì)胞中，LncRNA差異性表達(dá)及其本底表達(dá)情況，制定后續(xù)對應(yīng)的功能研究方案。

3）LncRNA亞細(xì)胞定位

LncRNA較細(xì)胞質(zhì)定位更多的是呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核定位狀態(tài)。除了現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫查詢和分析方式，一般需要通過FISH實(shí)驗(yàn)對LncRNA亞細(xì)胞定位進(jìn)行輔助驗(yàn)證。

定位在細(xì)胞核的LncRNA，可以與細(xì)胞核內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)等分子相互作用，實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)重塑、mRNA剪接、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等調(diào)控功能；

定位在細(xì)胞質(zhì)的LncRNA，多在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對編碼基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)mRNA翻譯或降解等，也可以參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路網(wǎng)格的調(diào)控。

2.LncRNA的功能研究篩選出差異表達(dá)的LncRNA，并利用QPCR、FISH等技術(shù)，檢測LncRNA在細(xì)胞/組織中的分布和表達(dá)量變化。接下來需要通過過表達(dá)、敲低、敲除等調(diào)控方式來改變LncRNA的表達(dá)量，再通過觀察細(xì)胞和動物模型中相關(guān)功能的變化，來明確LncRNA的生物學(xué)功能。

1）LncRNA的過表達(dá)調(diào)控

將全長LncRNA合成并構(gòu)建至非病毒載體（質(zhì)粒、體外合成等）或者病毒載體（慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等）上，以實(shí)現(xiàn)LncRNA的過表達(dá)調(diào)控。樣本組織中的表達(dá)水平：檢測不同組織以及不同階段的表達(dá)水平；細(xì)胞水平上的表達(dá)：檢測不同細(xì)胞中，LncRNA的表達(dá)水平。

2) LncRNA的敲低調(diào)控

敲低LncRNA的方式主要分為三類：a. 直接合成ASO；b. 直接合成siRNA靶點(diǎn)；c. 質(zhì)粒載體或者病毒載體表達(dá)shRNA 。研究LncRNA敲低調(diào)控時，首要考慮其亞細(xì)胞定位情況，據(jù)文獻(xiàn)報道[6]，針對于細(xì)胞核定位的LncRNA，使用ASO明顯比siRNA起到更好的干擾效果；針對于細(xì)胞質(zhì)定位的LncRNA，siRNA發(fā)揮出了更明顯的干擾調(diào)控優(yōu)勢；而對于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時定位的LncRNA，單獨(dú)使用siRNA或ASO都沒有前面兩種效果好，但聯(lián)合使用siRNA和ASO卻能達(dá)到更好的敲低效果。

圖4. LncRNA敲低工具效果對比圖[6]

3）LncRNA的敲除調(diào)控

針對于編碼基因的敲除，非3倍數(shù)堿基的插入/缺失會導(dǎo)致移碼突變，編碼提前終止等現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)編碼基因的敲除，但這些通過影響編碼基因正確編碼的手段并不能對LncRNA達(dá)到敲除效果。因此，要想實(shí)現(xiàn)LncRNA的敲除調(diào)控，則需要在基因組上LncRNA上下游各設(shè)計1個sgRNA，通過片段敲除的方式，實(shí)現(xiàn)LncRNA敲除的效果。

圖5. LncRNA敲除sgRNA位置[7]

3.LncRNA的機(jī)制研究1）LncRNA與DNA/RNA互作

RNA與DNA可以通過堿基互補(bǔ)配對形成RNA-DNA雜合鏈，這種互作形式對于細(xì)胞生命活動維持與遺傳信息調(diào)控具有重要生物學(xué)意義。綜述研究表示，RNA-DNA互作鑒定方法分為三種[8]：a. 針對特定RNA的互作DNA鑒定：使用與目標(biāo)RNA互補(bǔ)配對的探針進(jìn)行pulldown，將富集到的DNA進(jìn)行測序鑒定；b. 針對所有RNA-DNA互作的鑒定：采取兩種捕獲策略，一種是使用嵌合的RNA/DNA雙接頭，可以同步實(shí)現(xiàn)RNA和DNA的捕獲；另一種為分別捕獲互作的RNA和DNA；c. 針對特定DNA位點(diǎn)的RNA-DNA互作鑒定：采用dCas9策略富集與特定DNA區(qū)域互作的RNA。

LncRNA與RNA互作可以通過RNA pulldown、CHIRP等實(shí)驗(yàn)方法。設(shè)計與目標(biāo)RNA序列反向互補(bǔ)的生物素探針，把目標(biāo)RNA拉下來以后，則與其共同作用的RNA片段會被間接富集到鏈霉親和素磁珠上，最后通過qRT-PCR或測序來測定目的RNA。

2）LncRNA與蛋白互作

RNA pull down是用于檢測LncRNA結(jié)合蛋白與LncRNA互作的主要實(shí)驗(yàn)方法。通過體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，并與胞漿蛋白提取液共孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。復(fù)合物洗脫后，通過WB實(shí)驗(yàn)檢測特定的LncRNA結(jié)合蛋白是否與LncRNA相互作用。

3）ceRNA機(jī)制

通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫miR CODE、LNCBase等預(yù)測LncRNA-miRNA-mRNA軸上相關(guān)的靶基因。確定靶基因后，通過miRNA的種子序列或自由能結(jié)合方式進(jìn)行miRNA與LncRNA可能結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測，并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本期內(nèi)容針對LncRNA的簡介分類、功能、常用數(shù)據(jù)庫、研究思路及功能調(diào)控等四大方面進(jìn)行了詳細(xì)介紹，希望對LncRNA研究方向的小伙伴可以有所裨益。漢恒生物可以提供LncRNA過表達(dá)/干擾/敲除載體的構(gòu)建、以及LncRNA與miRNA/靶基因互作的雙熒光素酶驗(yàn)證服務(wù)等，并擁有專業(yè)的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊為您答疑解惑，有意向的小伙伴歡迎與我們聯(lián)系~下期我們將繼續(xù)為大家介紹另一種重要的非編碼RNA—circRNA，敬請關(guān)注！

參考文獻(xiàn)：

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[3]?? Robinson EK, Covarrubias S, Carpenter S. The how and why of lncRNA function: An innate immune perspective. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2020 Apr; 1863(4): 194419.

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[5]?? Chen J, Brunner AD, Cogan JZ, et al. Pervasive functional translation of noncanonical human open reading frames. Science. 2020; 367(6482): 1140-1146.

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[8]?? Li X, Fu XD. Chromatin-associated RNAs as facilitators of functional genomic interactions. Nat Rev Genet. 2019 Sep; 20(9): 503-519.