一、【實驗目的】

掌握Western Blot印跡法檢測蛋白質的實驗技術。

二、【實驗原理】

Western免疫印跡（Western Blot）廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。Western Blot原理是將經過PAGE膠分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

三、【實驗材料】

1. 試劑

（1）低分子量標準蛋白（Marker）

（2）過硫酸銨溶液(AP)：10克過硫酸銨溶于100 mL蒸餾水中(當天配制，4℃下只用1天為宜)

（3）煙草葉片

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）電泳緩沖液TBE (pH 8.3)：

30.3克Tris，144.2克甘氨酸，10克SDS,用蒸餾水溶解至1000 mL，用時稀釋10倍 (4℃下保存)

（6）轉膜緩沖液(20%甲醇，Tris-base 3 g/L，Glycine 14.4 g/L)

（7）TBST緩沖液(TBST 為150 mM NaCl，0.05% Tween-20，20 mM Tris-HCl pH=7.4)

（8）NC膜，濾紙，脫脂乳粉

（9）DAB顯色試劑盒

2. 儀器

電泳儀，垂直平板電泳槽，臺式離心機，微量進樣器，電轉儀，化學發(fā)光成像儀

四、【實驗步驟】

1. 蛋白的提取

SDS 裂解液提取蛋白：整個操作過程必須在冰上進行。

（1）取出煙草葉片進行稱量，每 0.5g 加入 1.5mL 裂解液（使用前加入PMSF 至終濃度 1 Mm / mL ）。

（2）用研杵棒將組織磨碎，冰上裂解 10min。

（3） 4℃離心，10000rpm，10min 。轉移上清至新的離心管中。

2. 凝膠電泳

（1）樣品制備：

將蛋白樣品與 2×上樣緩沖液在同一管中混勻（15μL上清+15μL 2×上樣緩沖液），金屬浴100℃加熱 10 min， 冷卻后取混合物上樣。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預染蛋白質分子量標準。

（2）凝膠制備：

將玻璃板，樣品梳清洗干凈，用去離子水潤洗數次，再用酒精擦拭干凈，晾干；將兩塊玻璃板固定裝好，按照以下說明制備分離膠：

向玻璃板間灌制分離膠，立即覆蓋一層雙蒸水以壓平膠，大約半小時膠便聚合完全。 按照如下體積配制濃縮膠：

將上層雙蒸水輕輕傾掉，用濾紙吸干，灌制濃縮膠，快速插入樣品梳。

（3） SDS-PAGE 電泳：

裝好電泳系統(tǒng)，加入電泳緩沖液試漏，加入電泳液；根據實驗要求上樣；將電流調至 10mA 進行凝膠電泳，當溴酚藍條帶到達分離膠后，將電流調大至 15mA ，直至溴酚藍跑至凝膠底部，即可停止。

（4）轉膜：

配制轉膜液并預冷轉膜液；

取出 PVDF 膜，在甲醇中浸泡 10s 左右，用雙蒸水清洗幾次；按照從下（負極）往上（正極）組裝轉膜裝置：海綿墊、 厚濾紙、凝膠、PVDF 膜、厚濾紙、海綿墊；卸下膠板，輕輕將凝膠剝離放于轉膜液中，轉移至濾紙上； 4℃ 恒流 200 mA , 轉膜 1h 。

（5）封閉：

轉膜結束后，把 PVDF 膜小心取出，然后把 PVDF 膜放入封閉液中，室溫搖床孵育 1h。

（6）一抗孵育：

封閉完畢取出 PVDF 膜，放入一抗稀釋液（1 : 1000 ）中，室溫孵育 1h。

（7）二抗孵育：

取出 PVDF 膜，用 1×TBST 緩沖液清洗 3 次，每次 5 min 。 然后把 PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育 1 h 。

（8） ECL 顯色

取出膜用 1×TBST 緩沖液清洗 3 次，每次 5 min ；按照說明書將等體積的 A、 B 工作液混勻，然后把顯色液均勻的滴在PVDF 膜上，避光孵育 5min ，曝光成像，觀察保存圖片。

五、【結果處理】

仔細觀察NC膜上顯示出的條帶變化，并拍照記錄。