寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2019年9月25日發(fā)表于Experimental & Molecular Medicine（2020IF：8.718，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Jianbing Huang教授，研究表明USP21/YY1/SNHG16軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的腫瘤增殖、遷移和侵襲。

研究背景

????????肺癌 (LC) 是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，85%的病例涉及非小細(xì)胞LC (NSCLC)。USP21 是去泛素化酶 (DUB) 家族的成員，可催化ubH2A的水解。USP21在非小細(xì)胞肺癌中的作用仍然未知。

摘要部分

????????作者使用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集和生物信息學(xué)分析并確定USP21是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤發(fā)生的潛在因素。作者進(jìn)一步證明USP21在NSCLC中高表達(dá)。隨后，作者進(jìn)行了體外和體內(nèi)檢測(cè)，以探索USP21對(duì)NSCLC進(jìn)展的影響以及所涉及的潛在機(jī)制。USP21通過介導(dǎo)其去泛素化來穩(wěn)定致癌基因YinYang-1(YY1)，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。此外，YY1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)SNHG16的表達(dá)。StarBase生物信息學(xué)分析也預(yù)測(cè)miR-4500靶向SNHG16和USP21。一系列體外實(shí)驗(yàn)表明SNHG16通過miR-4500增加USP21的表達(dá)。綜上所述，USP21/YY1/SNHG16軸在促進(jìn)NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮作用。因此，USP21/YY1/SNHG16/miR-4500軸可能是NSCLC治療的潛在治療靶點(diǎn)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP21在NSCLC中過度表達(dá)

????????為了了解DUB在NSCLC中的作用，作者使用癌癥基因組圖譜(TCGA)的肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)數(shù)據(jù)集分析了LC患者中USP21的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與鄰近的正常組織相比，USP21在LC組織中過表達(dá)。為了驗(yàn)證TCGA分析，作者測(cè)量了42對(duì)NSCLC樣本及其鄰近正常組織中USP21的mRNA水平。與相鄰的正常組織相比，USP21在LC組織中過度表達(dá)，從而證實(shí)了作者的初步觀察結(jié)果。為了進(jìn)一步證實(shí)這種表達(dá)模式，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以檢測(cè)USP21蛋白在LC組織和相鄰正常組織中的表達(dá)。IHC分析還顯示NSCLC腫瘤組織中USP21的染色比鄰近組織更強(qiáng)。接下來，作者檢查了NSCLC細(xì)胞系中的USP21表達(dá)。結(jié)果表明，與在16HBE正常肺細(xì)胞系中觀察到的相比，A549、H1299、NCI-H460和NCI-H520細(xì)胞系中USP21的表達(dá)更高。

研究結(jié)論：USP21在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織和細(xì)胞中過度表達(dá)。

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2.USP21促進(jìn)體外細(xì)胞增殖

????????作者進(jìn)一步研究了USP21在NSCLC進(jìn)展中的作用。選擇A549和NCI-H460細(xì)胞進(jìn)行USP21沉默和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。作者構(gòu)建了一個(gè)USP21 siRNA并將其轉(zhuǎn)染到A549和NCI-H460細(xì)胞中。通過qPCR和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)量并證實(shí)USP21沉默的效率。此外，作者構(gòu)建了一個(gè)USP21過表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)將其轉(zhuǎn)染到A549和NCI-H460細(xì)胞后，USP21顯著過表達(dá)。然后使用MTT測(cè)定研究USP21在NSCLC進(jìn)展中的作用。USP21過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而USP21沉默抑制細(xì)胞增殖。為了研究USP21對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，作者給小鼠接種了過表達(dá)USP21的NSCLC細(xì)胞。在接種USP21過表達(dá)細(xì)胞的小鼠中，腫瘤體積和腫瘤重量顯著增加。

研究結(jié)論：USP21在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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3.USP21促進(jìn)NSCLC遷移和侵襲? ? ?

????????作者通過進(jìn)行transwell測(cè)定并評(píng)估A549和NCI-H460細(xì)胞中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白，研究USP21在NSCLC遷移和侵襲中的作用。USP21過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，而USP21沉默抑制細(xì)胞遷移和侵襲。此外，E-cadherin被USP21過表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin被上調(diào)。然而，通過USP21沉默，E-鈣粘蛋白顯著上調(diào)，N-鈣粘蛋白下調(diào)。

研究結(jié)論：USP21促進(jìn)NSCLC遷移和侵襲。

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4.USP21通過YY1發(fā)揮致癌基因的作用

????????先前的研究表明YY1參與LC進(jìn)展。然而，尚不清楚USP21作為癌基因的作用是否由YY1介導(dǎo)。將一個(gè)USP21過表達(dá)質(zhì)?；騼蓚€(gè)USP21 siRNA轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。結(jié)果表明，USP21過表達(dá)并未增加YY1的mRNA表達(dá)，但顯著增加了YY1蛋白的水平。此外，USP21沉默并未降低YY1 mRNA的表達(dá)，但顯著降低了YY1的蛋白質(zhì)水平。這些結(jié)果表明USP21可能參與了YY1翻譯后修飾的調(diào)控。為了確認(rèn)YY1是否參與USP21的致癌作用，將A549細(xì)胞與USP21 siRNA和YY1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，YY1的過表達(dá)恢復(fù)了USP21沉默，抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。體內(nèi)腫瘤異種移植模型測(cè)定表明YY1敲低消除了USP21過表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。在si-USP21+YY1組小鼠中也觀察到了回補(bǔ)效應(yīng)，表明USP21可能通過YY1充當(dāng)癌基因。

研究結(jié)論：USP21通過YY1發(fā)揮致癌基因的作用。

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5.USP21使LC細(xì)胞中的YY1去泛素化? ? ?

????????因?yàn)閁SP21是DUB，作者檢查了USP21是否可以直接與YY1相互作用和去泛素化。發(fā)現(xiàn)USP21與YY1結(jié)合，如免疫共沉淀(co-IP)測(cè)定和GST下拉所示，表明USP21是YY1的直接結(jié)合伴侶。由于DUB參與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，作者接下來研究了USP21對(duì)YY1穩(wěn)定性的影響。A549細(xì)胞用放線菌酮處理以抑制蛋白質(zhì)合成，然后用USP21 siRNA轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明USP21沉默降低了YY1的穩(wěn)定性并增加了其降解。因此，作者推測(cè)USP21可能對(duì)YY1泛素化有影響。

????????先前的一項(xiàng)研究表明，保守的DUB的活性位點(diǎn)中His殘基的突變使它們催化失活。然后在野生型(wt)USP21或催化位點(diǎn)突變體USP21(USP21C221A)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中評(píng)估YY1水平。結(jié)果顯示用wt USP21而不是USP21 C221A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增加了YY1的相對(duì)水平。為了進(jìn)一步確認(rèn)YY1是USP21的去泛素化底物，檢查了USP21對(duì)YY1泛素化的影響。MG132用于抑制泛素化蛋白質(zhì)的降解，并且表明wtUSP21而不是催化位點(diǎn)突變體是導(dǎo)致YY1偶聯(lián)物減少的原因。然后將觀察到的高分子量綴合物純化并進(jìn)行YY1印跡，印跡表明wt USP21而不是USP21 C221A減少了YY1泛素化?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明USP21使LC細(xì)胞中的YY1去泛素化。

研究結(jié)論：USP21使LC細(xì)胞中的YY1去泛素化。

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6.YY1通過結(jié)合其啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄激活SNHG16? ? ?

????????之前的一項(xiàng)研究表明，lncRNA SNHG16在NSCLC患者中高表達(dá)。先前的研究還表明，YY1通過與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)lncRNA的表達(dá)。因此，作者探究YY1是否會(huì)影響SNHG16表達(dá)。作者構(gòu)建了一個(gè)YY1過表達(dá)質(zhì)粒和YY1 siRNA，然后將它們轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。結(jié)果表明，YY1過表達(dá)或USP21過表達(dá)顯著增加了SNHG16的表達(dá)，而YY1沉默或USP21沉默也顯著降低了SNHG16的表達(dá)。在JASPAR的幫助下，作者預(yù)測(cè)在lncRNA SNHG16的啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)YY1的結(jié)合位點(diǎn)。作者研究了YY1和SNHG16之間的相互作用。wt和突變體構(gòu)建體單獨(dú)或與YY1表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后wt SNHG16的啟動(dòng)子活性顯著增加；然而，在用SNHG16突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有觀察到變化。為了進(jìn)一步研究SNHG16是否是YY1的直接靶基因，作者使用抗YY1的抗體進(jìn)行ChIP分析。結(jié)果表明SNHG16啟動(dòng)子區(qū)域在YY1免疫沉淀的A549染色質(zhì)中顯著擴(kuò)增；然而，在對(duì)照IgG免疫沉淀的染色質(zhì)中未觀察到啟動(dòng)子區(qū)域。接下來，作者使用包含預(yù)測(cè)的YY1結(jié)合位點(diǎn)的核提取物和DNA探針進(jìn)行了EMSA。當(dāng)DNA探針與A549細(xì)胞的核提取物一起孵育時(shí)，觀察到一種特定的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并且該復(fù)合物在抗YY1抗體的存在下轉(zhuǎn)移到更高的位置。

?研究結(jié)論：SNHG16是YY1的直接靶基因。

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7.SNHG16通過靶向miR-4500調(diào)節(jié)USP21表達(dá)? ? ?

????????與腫瘤鄰近的正常組織相比，lncRNA SNHG16表達(dá)水平在腫瘤組織中顯著增加。此外，與腫瘤鄰近的正常組織相比，腫瘤組織中miR-4500的表達(dá)水平顯著降低。線性回歸相關(guān)分析結(jié)果表明，SNHG16的表達(dá)水平與miR-4500的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。如前所述，lncRNA可能充當(dāng)ceRNA來調(diào)節(jié)miRNA，因此作者想探究SNHG16是否以這種方式作用于miR-4500。

????????作者發(fā)現(xiàn)SNHG16 沉默顯著增加了miR-4500，USP21 和 YY1的表達(dá)，而用 miR-4500 模擬物處理也發(fā)揮了同樣的作用。使用Starbase生物信息學(xué)工具進(jìn)行的分析表明，SNHG16和USP21都直接與miR-4500相互作用。為了證實(shí)作者之前的結(jié)果，作者進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。在存在miR-4500的情況下，攜帶wt SNHG16或wt USP21的報(bào)告基因的熒光素酶活性大大降低，表明miR-4500可能直接結(jié)合和調(diào)節(jié)SNHG16和USP21。

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研究結(jié)論：lncRNA SNHG16抵消了miR-4500以促進(jìn)USP21表達(dá)。

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結(jié)論與討論

????????作者發(fā)現(xiàn)USP21去泛素化并穩(wěn)定YY1，并且YY1轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)ncRNA SNHG16，后者進(jìn)一步作為ceRNA來調(diào)節(jié)USP21。基于作者的研究結(jié)果，提出USP21-YY1-SNHG16軸在調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的惡性增殖中起著至關(guān)重要的作用。然而﹐USP21/YY1/SNHG16是否在反饋回路中發(fā)揮促癌作用需要進(jìn)一步研究?？傊?，該研究首次確定了USP21/YY1/SNHG16/miR-4500軸在NSCLC中的作用，可能為NSCLC的治療提供策略。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s12276-019-0356-6