說(shuō)下我的問(wèn)題，設(shè)計(jì)完引物，PCR產(chǎn)物在100bp很彌散的條帶，我以為是自己退火溫度問(wèn)題，設(shè)置梯度后也不行，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題出在了模板那里，優(yōu)化后的模板和原始的序列不匹配，真是離了大譜。所以在設(shè)計(jì)引物之前必須要思考清楚。

模板沒(méi)問(wèn)題的話，就該考慮下面為問(wèn)題了

第一個(gè)知乎大神

1.最好的辦法就是重新設(shè)計(jì)引物，一般來(lái)說(shuō)引物之間存在大量的堿基互補(bǔ)配對(duì)就會(huì)容易形成引物二聚體。推薦使用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，軟件里會(huì)清晰的顯示引物二聚體形成的情況。

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2. 如果不想重新設(shè)計(jì)引物，可以考慮提高退火溫度試一試，較高的退火溫度會(huì)大大降低引物二聚體的形成。

3.減少引物的使用量，建議把加入引物的量減少一半試試，一般PCR體系里引物是過(guò)量的，減少引物的量對(duì)PCR反應(yīng)影響不大，但是能一定程度上降低引物二聚體，畢竟引物少了，兩對(duì)引物間兩兩結(jié)合的概率也就低了。

其他知乎大神的分享

①引物自身沒(méi)設(shè)計(jì)好。引物設(shè)計(jì)的不好，自連系數(shù)過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，重新設(shè)計(jì)引物才能從根本上解決問(wèn)題！

②模板。模板有問(wèn)題，引物結(jié)合不上去；或者體系中模板的量少，濃度低，都會(huì)導(dǎo)致引物“沒(méi)事干”，引物自連的可能性蹭蹭蹭的往上漲！所以要摸索出適合這對(duì)引物的最佳體系。

③Taq酶的量太多，Mg2+的濃度過(guò)高，體系的擴(kuò)增性能太好了，引物的自連系數(shù)也跟著變高了，所以一個(gè)恰當(dāng)適中的擴(kuò)增體系是非常必要的。

④在反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)盡快進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。有的前輩已經(jīng)試驗(yàn)過(guò)了，擴(kuò)增產(chǎn)物在室溫放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話Taq酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體，所以各位小伙伴要合理安排試驗(yàn)時(shí)間，盡量將試驗(yàn)一氣呵成，耽擱的時(shí)間越久，試驗(yàn)結(jié)果的變數(shù)也就越大。

⑤以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行二次PCR，這樣可以提高反應(yīng)的特異性，減少引物二聚體，但是產(chǎn)物因?yàn)檫M(jìn)行過(guò)反復(fù)的擴(kuò)增，導(dǎo)致其濃度非常高，所以使用前可以進(jìn)行稀釋，一般100倍左右即可，但是也要因?yàn)楫a(chǎn)物的濃度進(jìn)行調(diào)整啦！

一千對(duì)引物，有一千種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更可能有不止一千種的意外發(fā)生，所以做實(shí)驗(yàn)要持之以恒。好的實(shí)驗(yàn)態(tài)度是成功的一半，那么另一半當(dāng)然就是可靠的試劑與儀器啦！三獅生物2×Taq PCR Master Mix（Taq酶預(yù)混液），科學(xué)配比添加了DNA Ploymerase、PCR Buffer及dNTP Mix等多種PCR原料，有含染料與不含染料（電泳時(shí)所必需的色素試劑）兩種供您選擇，您只需要添加模板、上游引物、下游引物和dd水便可進(jìn)行PCR反應(yīng)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，線性范圍廣，簡(jiǎn)單方便。另有普通PCR，熒光定量PCR的全線產(chǎn)品，為您的試驗(yàn)保駕護(hù)航！

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?第三個(gè)知乎大神

首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán)（由 95 °C 變性步驟直接進(jìn)入 60 °C 退火和延伸步驟）有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60 °C。可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。如果未對(duì)引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評(píng)估，則應(yīng)補(bǔ)充評(píng)估并考慮重新設(shè)計(jì)（如有需要）。通常情況下，最好使用熱啟動(dòng) DNA 聚合酶，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。在理論上，針對(duì)同一靶點(diǎn)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)引物組。這實(shí)際上可以節(jié)省大量時(shí)間，因?yàn)槿绻@些引物中的一個(gè)能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費(fèi)在優(yōu)化過(guò)程上的時(shí)間。

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