嘌呤霉素篩選的用途

Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基糖苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選能夠表達pac基因的細胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果表達該基因，就會對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩(wěn)定細胞株。目前，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標記為 puror)，可以利用嘌呤霉素的篩選，得到特定基因穩(wěn)定表達的細胞株。

Puromycin不僅能用于穩(wěn)定細胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細胞株的維持。Puromycin的作用特點是快速作用于細胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。

嘌呤霉素篩選的機制

嘌呤霉素是真核和原核生物中蛋白質(zhì)翻譯的有效抑制劑，其作用機制圖如下。嘌呤霉素通過模擬氨?；痶RNA(aa-tRNA) 的3'末端，代替正常氨基酸參與翻譯延長過程。它通過核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心(PTC)催化摻入新生鏈的C末端，阻止進一步延伸，導致翻譯過早的終止，從而抑制了蛋白質(zhì)合成，造成細胞死亡。

推薦工作濃度

推薦的作用于哺乳動物細胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/mL，但最佳工作濃度需要通過劑量反應(yīng)曲線來確定。

嘌呤霉素篩選的方法

01、將Puromycin按所需工作濃度添加到培養(yǎng)基中，用于待篩選細胞的培養(yǎng)；

02、逐步篩選：pac基因轉(zhuǎn)染48h后，用含有終濃度為2μg/mL的Puromycin的培養(yǎng)基換液；

03、傳代時，逐步增加Puromycin的濃度，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導的細胞株。推薦按照2/4/6/8/10的梯度逐漸增加Puromycin用量；

04、篩選過程中，建議不要使用細胞做實驗，抗生素會影響部分實驗結(jié)果。

嘌呤霉素維持的方法

1、定期篩選：連續(xù)培養(yǎng)的細胞篩選頻率為1-2個月，篩選時，將嘌呤霉素直接添加到培養(yǎng)基中，細胞正常培養(yǎng)傳代即可，每次篩選時間為一周，嘌呤霉素終濃度為4μg/mL；

2、長期凍存的細胞，復蘇后第二代待細胞狀態(tài)穩(wěn)定時，可進行篩選，維持陽性細胞比例。