本文主要介紹Edman降解測序的三個問題，那就是Edman降解測序究竟是門什么技術(shù)？我為什么要使用Edman測序？什么情況下不能使用這項技術(shù)？因此，對于對Edman測序技術(shù)陌生又著急能夠盡快讀懂Edman測序技術(shù)的科研小白，你們來對地方啦！

什么是Edman降解測序？

一句話簡單通俗地說就是Edman降解測序是通過化學(xué)反應(yīng)依次切下蛋白質(zhì)N端的每一個氨基酸，再使用HPLC液相色譜分別鑒定氨基酸的ID，得到的氨基酸信息排序結(jié)果即為蛋白質(zhì)N端的序列。接下倆，我們用測定蛋白質(zhì)N端的第一個氨基酸為例來解釋一下單個Edman測序反應(yīng)的整個過程是怎樣的.

Edman降解法測定蛋白質(zhì)N端首位氨基酸的流程

首先，蛋白質(zhì)N端的a氨基與PITC發(fā)生偶聯(lián)作用，偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果就是PITC被連接到蛋白質(zhì)的N端。接著用三氯乙酸（TFA）處理PITC-蛋白復(fù)合物，在三氯乙酸的作用下，PITC和它連接第一個氨基酸可以被特異地切割下來，形成PITC-氨基酸復(fù)合物。緊接著這個PITC-氨基酸被萃取分離出來。隨后PITC-氨基酸被轉(zhuǎn)成更為穩(wěn)定的PTH-氨基酸形體。PTH-氨基酸經(jīng)由HPLC色譜鑒定出色譜圖，再與標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸色譜圖進(jìn)行比較，從而獲得首位氨基酸的信息。同理，按照這個方法依次測定余下的氨基酸序列，即可獲得蛋白質(zhì)N端的氨基酸序列信息。

什么情況下使用Edman測序？

根據(jù)Edman測序的原理，我們可以知道Edman測序的起始點(diǎn)是從蛋白質(zhì)N端的a游離氨基開始的，再依按從N端到C的方向依次測定氨基酸序列的。因此，不難理解Edman測序可以應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)N端序列測定，包括重組蛋白、蛋白亞型、抗體、多肽等。

Edman測序法相比傳統(tǒng)質(zhì)譜法的優(yōu)勢

Edman測序法可以直接分析氨基酸信息，并且不需要借助任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此，Edman測序可以對全新的沒有數(shù)據(jù)庫信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行N端序列分析。而傳統(tǒng)的質(zhì)譜測序法則需要借助已知的蛋白數(shù)據(jù)庫，將測定的多肽序列與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，再對蛋白的ID和序列進(jìn)行推測，所以，傳統(tǒng)質(zhì)譜法不能對數(shù)據(jù)庫中不包含的蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。另外，質(zhì)譜法也不能夠準(zhǔn)確區(qū)分分子量相近的氨基酸（I/L、Q/K），以及蛋白質(zhì)上的突變位點(diǎn)。Edman測序?qū)τ贜端突變／改造蛋白的測序可以提供直接測序測定，并且更為準(zhǔn)確。這也是為什么即使Edman測序至今仍被稱為蛋白質(zhì)N端序列分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

Edman測序的局限性

Edman測序主要的有幾個局限性：通量較低，無法對多個蛋白質(zhì)進(jìn)行同時分析，分析過程也相對耗時，對每個殘基測試需花費(fèi)45分鐘時間，且每個殘基測試的費(fèi)用成本較高。另外，由于Edman測序的起始點(diǎn)是從蛋白質(zhì)N端的游離的a氨基開始，因此對于N端封閉（a氨基具有乙酰化、甲基化、焦谷氨酸化等修飾）這一類不具有游離的a氨基的蛋白質(zhì)，Edman降解測序的反應(yīng)是無法進(jìn)行的，因此也就無法對這類樣品直接進(jìn)行N端測序。

由于Edman一般對蛋白質(zhì)N端50個左右氨基酸序列進(jìn)行測定，對于分析蛋白質(zhì)全長序列具有一定的局限性。但是使用Edman測序法對蛋白全長序列進(jìn)行分析也是可以實(shí)現(xiàn)的，只需要將蛋白質(zhì)酶切成多個短肽，再利用Edman測序法分析各個短肽的序列，就可以拼接成蛋白全長序列。

說到這里，您肯定想問小編既然Edman測序?qū)τ诘鞍譔端測序有很高的精準(zhǔn)度，那么有沒有針對解決這些Edman的局限性的方法呢？答案是有的，針對通量的問題，我們可以結(jié)合質(zhì)譜鑒定和Edman測序的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)高通量的蛋白鑒定和精準(zhǔn)序列測定。另外，對于N端封閉的情況，可以根據(jù)具體情況選擇相應(yīng)的酶去除蛋白N端的修飾，或者使用質(zhì)譜鑒定的方法鑒定N端的修飾。針對Edman測序和質(zhì)譜測序兩種方法的有缺點(diǎn)，在蛋白質(zhì)樣品N端測序過程中相互相互補(bǔ)充，取長補(bǔ)短。