關于真核生物DNA復制過程研究的思考

——Structural Mechanisms for?Replicating DNA in?Eukaryotes閱讀心得

寫在前面

? ? 怎么說呢，這個系列就是把自己的homework拿出來曬一曬，也就是圖一樂丟人現(xiàn)眼一下，因為本人能力和知識范圍有限，難免會有錯誤，請諒解一下，也就是僅供參考。引文都有標注，如果有侵權的可以聯(lián)系我。歡迎各位大佬多交流，提問題、指錯誤。要是能關注一波那就更好了??

1 DNA復制

DNA是生物遺傳信息的載體，生命的遺傳實際上是DNA自我復制的結果。因而，準確穩(wěn)定的復制過程是生命延續(xù)的基礎，但雙鏈DNA的復制是一個極其復雜的過程，在復制地起始、延伸、終止三個階段，無論是真核生物還是原核生物都需要多種酶與蛋白質的協(xié)同參與。

從Watson 和Crick 在提出DNA雙螺旋結構時人類就開始了對DNA的復制過程的探索，時至今日，DNA的復制方式與復制過程已被大致明了，但更加精細的中間過程卻一直未被完全闡明。近年來，結構研究方面的技術進步，特別是同步輻射源和低溫電子顯微鏡（cryo-EM）的，使人們能夠測定更大、更短暫、更復雜的結構，使DNA復制過程研究的階段深入到原子層面。[1-2]

2 真核生物的DNA復制

2.1 DNA復制的起始

在真核生物細胞中，DNA復制僅僅是細胞周期的一部分，只在S期進行，但其起始過程的橫跨兩個時期：對指導復制起始的序列進行識別發(fā)生在G1期，隨后的起始點激活發(fā)生在S期，這保證了每條染色體在每個細胞周期中只復制一次。由4個獨立的蛋白質組成的前復制復合體pre-RC 的形成介導了復制器的選擇。

首先真核生物DNA復制的起始需要起始點識別復合物（origin recognition complex,ORC）參與，ORC是雜六聚體，由6個亞基（Orc1-6）構成，其中Orc1-5共用一個相關結構。ORC具有類似原核起始蛋白的AAA+與WH（winged helix，有翼螺旋）結構域，后者具有DNA結合功能。ORC會優(yōu)先結合復制起始點ARS（自主復制序列）共有基序（ACS）位點的11個堿基對（bp）序列，然后再通過AAA +域的起始蛋白特異性基序（ISM）與DNA的磷酸核糖骨架結合，WH域通過一個進入DNA大溝的β－發(fā)夾motif結合DNA。這些作用在DNA離開ORC的中央通道時使其彎曲，有助于解旋酶Mcm2-7的裝載。

ORC 結合復制起始位點后，會招募兩個解旋酶裝載蛋白Cdc6和Cdt1，再共同募集真核復制叉解旋酶Mcm2 ～7復合體，形成pre-RC(Fig1)。之后再將CDC6和CDT1從染色質中釋放出來，以防止MCM2-7重新加載，使其保持惰性，保證每個細胞周期只復制一次。在S期， CDC45和DNA復制復合物Go-Ichi-Ni-San（GINS）與MCM2-7六聚體結合形成CDC45 / MCM2-7 / GINS（CMG）復合物，激活MCM的解旋酶活性。[2-3]

2.2 DNA鏈的延伸

在真核生物DNA復制時，由于DNA雙螺旋的反平行性質，前導鏈可由DNA聚合酶α與引發(fā)酶形成復合體利用dNTP延伸，進行連續(xù)合成，由于DNA聚合酶α缺乏校對能力，進一步的引物延伸由聚合酶δ主要負責，后隨鏈與DNA復制叉前進相反方向延伸，由DNA聚合酶ε不連續(xù)合成。在產(chǎn)生短的岡崎片段的過程中，DNA聚合酶δ能夠遷移到下游前一片段上的引物的有限部分中取代該部分，從而產(chǎn)生一個ssRNA片段，該片段可由核酸內(nèi)切酶1（FEN1）蛋白切除。最后相鄰的岡崎片段被DNA連接酶I連接。

真核復制體面臨著一項挑戰(zhàn)性的任務，即招募DAN聚合酶α、δ、ε并使其與CMG解旋酶的解旋的DNA鏈同步，以催化前導鏈和后隨鏈合成。此外，參與穩(wěn)定解旋、促進岡崎片段成熟以及與核小體去除和沉積競爭的輔助因子的活性也必須進行精細協(xié)調(diào)，以群準確地復制染色體。增殖細胞核抗原（PCNA）在復制聚合體中起至關重要的作用，PCNA最初被稱為DNA滑動夾（DNA sliding clamp），認為它的作用是提高聚合酶的效率。隨后的研究表明，它可與多種分子相互作用，從而參與多種代謝途徑，包括DNA的復制與修復、DNA甲基化、染色質重塑和細胞周期調(diào)控等。[1-3]

2.3 DNA鏈的終止

真核生物在染色體的多個起始點開始DNA復制，因此復制叉在會染色體的起始點處相遇并終止。由于真核生物具有線性染色體，DNA復制無法到達染色體的最末端，造成末端缺失問題，由于這個問題，使得染色體末端的DNA在每個復制周期中都會丟失，一般由近末端的重復DNA區(qū)域－端粒防止基因丟失。[1]

3 思考與展望

??目前，雖然DNA復制過程已大致明了，但相關的酶與蛋白如何關聯(lián)，如何結合，經(jīng)歷何種構象改變促使DNA復制過程的順利啟動與完成等問題仍然需要深入探索。隨著結構研究技術的不斷發(fā)展，更多結構中間體圖像的不斷拍攝，更多復制相關調(diào)節(jié)機制的不斷闡明，我們對DNA復制過程會有更加清晰的認知。

同時，我們或許也可以關注古菌等極端微生物的DNA復制過程的與模式生物復制過程的比對，可能會發(fā)現(xiàn)某些獨特的因素差異，用于改良體外DNA復制體系等拓展研究。

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參考文獻：

[1]?朱玉賢，李毅編著. 現(xiàn)代分子生物學[M]. 北京：高等教育出版社，?2019.06.

[2]?Attali I, Botchan MR, Berger JM. Structural Mechanisms for Replicating DNA in Eukaryotes. Annu Rev Biochem. 2021 Jun 20;90:77-106. doi: 10.1146/annurev-biochem-090120-125407. Epub 2021 Mar 30. PMID: 33784179.

[3]?https://zhuanlan.zhihu.com/p/105706399