寫在前面

????????今天推薦的是由美國紐約州石溪大學(xué)藥理學(xué)系在2019年3月28日發(fā)表于Cell Death & Disease（IF：5.967，JCR 2區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Chia-Hsin Chan教授，研究表明抑制USP2可消除癌癥干細(xì)胞并增強(qiáng)TNBC對化療的反應(yīng)性。

研究背景

????????三陰性乳腺癌（TNBC）是最具侵略性的乳腺癌亞型，在腫瘤中蘊(yùn)藏著豐富的癌癥干細(xì)胞（CSC）種群。傳統(tǒng)的化療是TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但它對導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展的CSC群體治療效果較差。因此，確定控制CSC活性和擴(kuò)展的核心分子途徑對于開發(fā)有效的TNBC治療方法至關(guān)重要。

摘要部分

????????作者表明，USP2通過激活自我更新因子Bmi1和通過Twist上調(diào)實(shí)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來維持CSC群體。從機(jī)制上講，USP2通過消除β-TrCP介導(dǎo)的Twist泛素化促進(jìn)Twist的穩(wěn)定。動物研究表明，藥物抑制USP2可以抑制腫瘤的發(fā)展，并使腫瘤對TNBC的化療反應(yīng)敏感。這表明針對USP2是解決TNBC的一種新的治療策略。

研究內(nèi)容

1.USP2基因在TNBC中上調(diào)，對TNBC中CSCs的擴(kuò)增至關(guān)重要? ? ?

????????作者通過cBioPortal對癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，USP2基因在大約20%的基底樣乳腺腫瘤中是上調(diào)的。由于大多數(shù)（>85%）TNBC樣本被歸入基底樣亞型，這一觀察結(jié)果促使作者探究USP2在基底樣TNBC中的潛在病理學(xué)作用。TNBC是乳腺癌中最具侵略性的亞型，具有CSC富集的特點(diǎn)。作者根據(jù)從BT549中分離出CSC群體，發(fā)現(xiàn)TNBC的CSC群體中USP2的表達(dá)明顯高于非CSCs。

????????作者隨后調(diào)查了USP2對CSC活性的影響。腫瘤球的形成實(shí)驗(yàn)表明，USP2的過表達(dá)增加了三種基底類TNBC細(xì)胞模型--BT549、MDA-MB-231和MDA-MB-157中腫瘤球的形成和數(shù)量。相反，敲除USP2的表達(dá)可以減少各種TNBC細(xì)胞系中腫瘤球的大小和數(shù)量。與這些觀察一致，ALDEFLUO試驗(yàn)表明，USP2的敲低明顯減少了CSC群體。這些結(jié)果表明，USP2在CSCs的自我更新和擴(kuò)展中起著重要作用。ML364直接與USP2結(jié)合并選擇性地抑制其酶活性，作者證明，ML364對USP2的藥理抑制以劑量依賴的方式明顯減少了TNBC腫瘤球的形成。

研究結(jié)論：SP2在CSCs的自我更新和擴(kuò)展中起著重要作用，抑制USP2是針對CSCs的一種有前途的治療方法。

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2.USP2的缺失增強(qiáng)了TNBC細(xì)胞和CSCs對化療的敏感性? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除或抑制USP2會降低TNBC細(xì)胞的活力。ML364對USP2的抑制大大增強(qiáng)了多柔比星或紫杉醇在多種TNBC細(xì)胞模型中的細(xì)胞毒性。為了闡明ML364與多柔比星的組合效應(yīng)是否歸因于USP2，作者用ML364處理Luciferas-和USP2-nockdown BT549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ML364處理增強(qiáng)了多柔比星對Lucifase-nockdown BT549細(xì)胞的療效，但同樣的處理并沒有進(jìn)一步抑制USP2-nockdown細(xì)胞的生長，說明ML364通過抑制USP2增強(qiáng)了多柔比星的療效。

????????作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ML364與多柔比星聯(lián)合使用可協(xié)同消除今天推薦的是由美國紐約州石溪大學(xué)藥理學(xué)系在2019年3月28日發(fā)表于Cell Death & Disease（IF：5.967，JCR 2區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Chia-Hsin Chan教授，研究表明抑制USP2可消除癌癥干細(xì)胞并增強(qiáng)TNBC對化療的反應(yīng)性。

????????在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)USP2去泛素化酶在CSCs中上調(diào)，是CSCs的一個新的調(diào)節(jié)器。對USP2進(jìn)行遺傳和藥物靶向治療，可大幅抑制CSCs的自我更新、擴(kuò)展和化療抗性。作者表明，USP2通過激活自我更新因子Bmi1和通過Twist上調(diào)實(shí)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來維持CSC群體。從機(jī)制上講，USP2通過消除β-TrCP介導(dǎo)的Twist泛素化促進(jìn)Twist的穩(wěn)定。動物研究表明，藥物抑制USP2可以抑制腫瘤的發(fā)展，并使腫瘤對TNBC的化療反應(yīng)敏感。此外，組織學(xué)分析顯示，USP2上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在正相關(guān)。作者的研究結(jié)果共同證明了USP2在介導(dǎo)Twist激活和CSC富集方面的具有重要作用，這表明針對USP2是解決TNBC的一種新的治療策略。

????????通過cBioPortal對癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，USP2基因在大約20%的基底樣乳腺腫瘤中是上調(diào)的。由于大多數(shù)（>85%）TNBC樣本被歸入基底樣亞型，這一觀察結(jié)果促使作者探究USP2在基底樣TNBC中的潛在病理學(xué)作用。TNBC是乳腺癌中最具侵略性的亞型，具有CSC富集的特點(diǎn)。作者根據(jù)從BT549中分離出CSC群體，發(fā)現(xiàn)TNBC的CSC群體中USP2的表達(dá)明顯高于非CSCs。

????????作者隨后調(diào)查了USP2對CSC活性的影響。腫瘤球的形成實(shí)驗(yàn)表明，USP2的過表達(dá)增加了三種基底類TNBC細(xì)胞模型--BT549、MDA-MB-231和MDA-MB-157中腫瘤球的形成和數(shù)量。相反，敲除USP2的表達(dá)可以減少各種TNBC細(xì)胞系中腫瘤球的大小和數(shù)量。與這些觀察一致，ALDEFLUO試驗(yàn)表明，USP2的敲低明顯減少了CSC群體。這些結(jié)果表明，USP2在CSCs的自我更新和擴(kuò)展中起著重要作用。ML364直接與USP2結(jié)合并選擇性地抑制其酶活性，作者證明，ML364對USP2的藥理抑制以劑量依賴的方式明顯減少了TNBC腫瘤球的形成。

????????鑒于USP2在CSC調(diào)節(jié)中的重要作用，作者試圖確定USP2的抑制是否會增加TNBC對多柔比星和紫杉醇的敏感性。作者發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除或抑制USP2會降低TNBC細(xì)胞的活力。此外，ML364對USP2的抑制大大增強(qiáng)了多柔比星或紫杉醇在多種TNBC細(xì)胞模型中的細(xì)胞毒性。為了闡明ML364與多柔比星的組合效應(yīng)是否歸因于USP2，作者用ML364處理Luciferas-和USP2-nockdown BT549細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，ML364處理增強(qiáng)了多柔比星對Lucifase-nockdown BT549細(xì)胞的療效，但同樣的處理并沒有進(jìn)一步抑制USP2-nockdown細(xì)胞的生長，說明ML364通過抑制USP2增強(qiáng)了多柔比星的療效。

????????另一方面，作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ML364與多柔比星聯(lián)合使用可協(xié)同消除BT549和MDA-MB-157細(xì)胞中的CSC群體。此外，ALDEFLUO檢測也有同樣的聯(lián)合治療效果。

?研究結(jié)論：對USP2的藥理抑制有可能被用來提高TNBC的化療效果。

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3.USP2通過穩(wěn)定Twist蛋白的表達(dá)調(diào)控Bmi1??? ?

????????最近的研究表明， Bmi1在維持CSC更新和CSC介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生方面起著不可缺少的作用。作者隨后探究USP2過度表達(dá)Bmi1的分子機(jī)制。先前報道指出Twist是Bmi1的轉(zhuǎn)錄因子，Twist過表達(dá)會增加Bmi1在各種癌細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)。與這些觀察一致，BT549細(xì)胞中Twist的敲除減少了Bmi1的蛋白表達(dá)，表明USP2通過Twist對Bmi1的誘導(dǎo)發(fā)揮作用。BT549和MDA-MB-157 TNBC細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的Twist。? ? ?

????????Western blot檢測表明，在BT549和MDA-MB-157細(xì)胞中消減USP2的表達(dá)，大大降低了Twist的蛋白表達(dá)。此外，在USP2基因沉默后，Bmi1蛋白水平被發(fā)現(xiàn)下調(diào)。作者的Western blot和實(shí)時PCR檢測表明，USP2的缺乏抑制了TNBC細(xì)胞中包括Ncadherin和Fibronectin在內(nèi)的間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果突出表明，USP2是Twist的一個真正的上游調(diào)節(jié)器，并且是誘導(dǎo)Bmi1和EMT的原因。

????????為了進(jìn)一步確定USP2在CSC群體中Twist蛋白表達(dá)中的作用，作者分析了從Lucifere-和USP2-knockodwn BT549和MDA-MB-157細(xì)胞中分離出的Twist蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)USP2的耗竭大大降低了腫瘤球體中的Twist蛋白水平。

研究結(jié)論：USP2是Twist的一個真正的上游調(diào)節(jié)器，并且是誘導(dǎo)Bmi1和EMT的原因，USP2在TNBC細(xì)胞和CSC群體中都能調(diào)節(jié)Twist蛋白的表達(dá)。

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4.USP2通過裂解β-TrCP對Twists的蛋白去泛素化來穩(wěn)定Twist

????????作者進(jìn)行了IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在BT549細(xì)胞中，內(nèi)源性USP2和Twist之間有強(qiáng)烈的相互作用。MG132處理逆轉(zhuǎn)了由USP2敲低介導(dǎo)的Twist下調(diào)。同樣，在BT549和MDA-MB-157細(xì)胞中，由USP2抑制劑引起的Twist蛋白表達(dá)減少在MG132處理后得到了回補(bǔ)。這些結(jié)果表明，USP2通過防止蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白分解來穩(wěn)定Twist蛋白的表達(dá)。? ? ?

????????泛素化試驗(yàn)顯示，在MG132的存在下，過量表達(dá)野生型（WT）USP2能有效地去除Twist的泛素化，而USP2的酶活性C276A突變體則不能觸發(fā)Twist的這種去泛素化事件。β-TrCP是一個主要的E3連接酶，能促進(jìn)Twist泛素化，導(dǎo)致Twist的蛋白體降解。作者的數(shù)據(jù)顯示，β-TrCP驅(qū)動的Twist泛素化被過量表達(dá)的USP2所抑制。K63連接的泛素化引導(dǎo)Twist定位到細(xì)胞核，以激活Twist在EMT和CSCs的功能。因此，作者研究了USP2是否能潛在地改變Twist的亞細(xì)胞定位。生化分餾試驗(yàn)和免疫熒光染色表明，ML364抑制USP2后，Twist在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中的表達(dá)都被下調(diào)。

????????作者接下來描述了被USP2去除的Twist的泛素連接，發(fā)現(xiàn)USP2主要去除Twist的K48連接的多泛素化。這些結(jié)果表明，USP2通過拮抗Twist的K48連接的泛素化來穩(wěn)定Twist。為了闡明USP2調(diào)節(jié)的Twist蛋白表達(dá)和腫瘤球的形成是否取決于其去泛素酶的活性，作者敲除USP2的細(xì)胞中重新表達(dá)了WT和催化不活躍的C276A突變體，shUSP2 #1。Western blot和腫瘤球形成試驗(yàn)表明，由USP2敲除介導(dǎo)的Twist蛋白水平下降和腫瘤球被WT而不是USP2的C276A突變體所回補(bǔ)。

研究結(jié)論：USP2是Twist和CSCs的真正調(diào)控者，而且這些USP2的功能取決于USP2的去泛素酶活性。

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5.USP2通過Twist/Bmi1途徑調(diào)控癌細(xì)胞遷移和CSC更新

????????作者接下來研究了USP2是否協(xié)調(diào)了基底類TNBC細(xì)胞的遷移。遷移試驗(yàn)顯示，敲除USP2的表達(dá)會抑制癌細(xì)胞的遷移，反之，USP2的過表達(dá)會促進(jìn)這種效果。此外，Twist促進(jìn)的細(xì)胞遷移和CSC更新在ML364處理中被下調(diào)，說明了USP2和Twist之間的功能聯(lián)系。作者接下來測試了抑制Bmi1對Twist誘導(dǎo)的腫瘤球的形成的影響,作者發(fā)現(xiàn)，PTC-209（Bmi1特異性小分子抑制劑）處理有效地減少了Twist誘導(dǎo)的腫瘤球的形成，再現(xiàn)了USP2對CSC自我更新的影響。

研究結(jié)論：USP2在CSC激活中功能的一個關(guān)鍵機(jī)制是wist/Bmi1途徑。

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6.藥理抑制USP2可抑制腫瘤生長并增強(qiáng)腫瘤對多柔比星的敏感性

????????抑制Bmi1已被證明可以提高乳腺癌細(xì)胞對5-FU和輻射的敏感性。作者隨后確定USP2的抑制是否會影響預(yù)先存在的TNBC的生長和化學(xué)敏感性。作者首先在免疫缺陷的小鼠中建立了BT549衍生的異種移植。腫瘤發(fā)生試驗(yàn)表明，ML364對BT549-衍生的腫瘤的重量和體積都表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制。? ? ?

????????免疫組化染色結(jié)果表明，ML364處理異種移植小鼠明顯減少了腫瘤中Twist和Bmi1蛋白的表達(dá)，支持USP2通過Twist/Bmi1軸調(diào)節(jié)TNBC發(fā)展的結(jié)論。

????????鑒于USP2在消除CSC方面的深刻作用和與多柔比星的協(xié)同作用，作者測試多柔比星和ML364對TNBC腫瘤的聯(lián)合治療。作者的異種移植研究表明，低劑量的多柔比星僅能小幅抑制BT549衍生腫瘤的發(fā)展，但與ML364的聯(lián)合治療能使腫瘤對多柔比星的療效更強(qiáng)。

研究結(jié)論：USP2抑制腫瘤生長并使腫瘤對預(yù)先存在的TNBC異種移植物的化療反應(yīng)更敏感。

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7.USP2在高級別腫瘤中上調(diào)，USP2的表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)

????????對TNBC患者衍生的異種移植的高級單細(xì)胞測序分析顯示，CSCs是TNBC3中轉(zhuǎn)移的起始因素。此外，作者的數(shù)據(jù)表明，USP2調(diào)節(jié)了TNBC細(xì)胞的遷移能力。為了探究USP2在癌癥進(jìn)展中的潛在臨床意義，作者對223例乳腺腫瘤組織的USP2表達(dá)進(jìn)行了免疫組化染色。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者切除的乳腺腫瘤中，USP2的表達(dá)是上調(diào)的。此外，乳腺腫瘤中的USP2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的階段（pN階段）呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，USP2與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)。此外，作者表明，USP2的表達(dá)與乳腺腫瘤標(biāo)本中Twist和Bmi1的表達(dá)呈正相關(guān)。新數(shù)據(jù)支持USP2和Twist/Bmi1途徑之間的功能聯(lián)系。?

研究結(jié)論：USP2在TNBC中過量表達(dá)會促進(jìn)Twist/Bmi1的表達(dá)、CSC擴(kuò)展、癌細(xì)胞遷移和腫瘤發(fā)展。抑制USP2是消除CSCs和規(guī)避TNBC化療阻力的可行策略。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP2是Twist和CSCs的一個新型激活劑，它可以通過減少Twist泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解來穩(wěn)定Twist表達(dá)。此外，研究表明，USP2是激活Twist/Bmi1途徑和Twist介導(dǎo)的CSC特性所必需的。對USP2的遺傳和藥理抑制與化療藥物對CSC的消除顯示出深刻的協(xié)同作用動物研究表明，USP2抑制劑能明顯抑制腫瘤生長，提高TNBC的化療療效。此外，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， USP2蛋白的上調(diào)與乳腺腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。USP2介導(dǎo)的Twist/Bmi1通路代表了除EMT外對CSC調(diào)節(jié)至關(guān)重要的細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制，并提供了臨床前證據(jù)，表明靶向USP2確實(shí)是一種有潛力的抗CSC療法。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-019-1512-6