二、實(shí)驗(yàn)材料

l?主要試劑

l?主要儀器及器材

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 蛋白樣品制備：

a.收集10^7個(gè)細(xì)胞至 1.5 mL EP 管內(nèi)，并用預(yù)冷 1×PBS洗滌兩次；

b.加入800ul IP裂解液（提前加入蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑），混勻后置于冰上裂解30 min；

c.離心收集上清液(4℃, 17000 g,10 min)，取20ul作為input，于-80℃凍存；剩余樣本置于冰上備用（或置于-80℃長(zhǎng)期保存）。

2. 磁珠預(yù)處理：

a.將ProteinA/G磁珠漩渦振蕩1 min，使磁珠充分重懸；

b.取 30μL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中,加入200 μL結(jié)合液洗滌，進(jìn)行磁性分離（將EP管放置于磁力架上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清）；

c.棄上清液，從磁力架上取下EP管，重復(fù)洗滌一次。

d.最后加入200 μL結(jié)合液洗滌重懸磁珠以備用。

3. 抗體結(jié)合反應(yīng)：

a.抗體工作液的制備：結(jié)合液稀釋抗體樣品，配制成1:50抗體工作液，置于冰上備用。(抗體具體用量參考抗體說(shuō)明書)

b.抗體吸附：將步驟 2預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，棄上清液；加入200μL抗體工作液，迅速重懸后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀30 min 后進(jìn)行磁性分離;

c.洗滌：向EP管中加入200 μL結(jié)合液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散,然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液;

d.重復(fù)以上洗滌操作一次。

4. 抗原沉淀反應(yīng)

a.加入200 μL步驟1中制備的蛋白樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀1 h（或者在 4℃下反應(yīng)過(guò)夜），使抗原與抗體充分結(jié)合;

b.將上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離,棄上清液;

c.向EP管中加入 200 μL 結(jié)合液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，并于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上混勻2min，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液；

d.重復(fù)上步驟兩次，即共洗滌三遍。

e.最后加入200 μL 洗滌緩沖液，用移液器將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP 管中，并執(zhí)行磁性分離，移棄上清。

5. 抗原洗脫：

加入適量Loading Buffer（ 自備）混合均勻，100℃加熱10 min。然后執(zhí)行磁性分離收集上清液進(jìn)行WB驗(yàn)證或質(zhì)譜鑒定。

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三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 銀染結(jié)果

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2.WB檢測(cè)結(jié)果

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四、項(xiàng)目?jī)?nèi)容

廣州如期生物技術(shù)有限公司成立于2016年，始終以探索科學(xué)、服務(wù)客戶為己任；致力于為高校、科研院所、醫(yī)院、制藥企業(yè)提供全面、便捷、專業(yè)的技術(shù)服務(wù)和產(chǎn)品。技術(shù)方面我們專注于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：公司擁有完善的技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，覆蓋分子生物學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)，表觀遺傳等多個(gè)科研平臺(tái)。在產(chǎn)品方面，自主研究多種類型科研試劑盒20多項(xiàng)，如：COIP、CHIP、RIP等科研檢測(cè)試劑盒，較之同類型的進(jìn)口試劑盒，極大的降低了科研成本。

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