實(shí)驗(yàn)原理
鼠胚原代培養(yǎng)是一種原代培養(yǎng)類(lèi)型，指從孕鼠中取出合適胎齡的胎鼠，從特定組織中分離出細(xì)胞，并在適宜條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)（即達(dá)到匯合狀態(tài)）。在此階段，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基的新容器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（即傳代），以提供更多的繼續(xù)生長(zhǎng)空間。

實(shí)驗(yàn)步驟
1、鼠胚原代培養(yǎng)：
1.在做實(shí)驗(yàn)之前，需要將超凈工作臺(tái)或生物安全柜的紫外燈提前照射30分鐘。
1.2.實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：采用懷孕的母鼠作為材料，采用頸椎脫臼的方式進(jìn)行安樂(lè)死，然后把整個(gè)鼠體浸泡在盛有純酒精的燒杯中，時(shí)間為1分鐘。隨后將母鼠放置在不銹鋼手術(shù)盤(pán)里，采用無(wú)菌手術(shù)剪打開(kāi)其腹腔，取出鼠胚并放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。請(qǐng)注意，取樣過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌操作臺(tái)外進(jìn)行。
1.用70-75%的酒精擦拭裝有鼠胚的培養(yǎng)皿外圍后，將培養(yǎng)皿移至超凈工作臺(tái)或生物安全柜中。采用含有雙抗Hanks液的洗滌鼠胚，并進(jìn)行多次洗滌以去除血液污漬。在體視顯微鏡下進(jìn)行操作，采用無(wú)菌手術(shù)器械去除過(guò)多組織，并用解剖鑷剖取所需要的組織。將組織轉(zhuǎn)移到含有解離液或培養(yǎng)基的50ml離心管中，采用眼科剪將組織剪碎成1立方毫米的肉糜狀。
1.將解離液或培養(yǎng)基加入含有組織的50毫升離心管中，直至達(dá)到10毫升容量。首先采用10毫升彎頭滴管對(duì)組織進(jìn)行5-10次的吹打操作，然后使用1毫升的槍頭對(duì)組織吹打，最后采用200微升的尖端進(jìn)行吹打。
1.將上述組織懸液采用70μm過(guò)濾器過(guò)濾，以切碎和分散組織懸浮液，然后以l200rpm的速度，在4℃下離心10分鐘。
1.將以前的培養(yǎng)基棄掉，用預(yù)先配好的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到經(jīng)多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。把它置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，三天后更換培養(yǎng)液。之后每?jī)商煨枰鼡Q細(xì)胞培養(yǎng)液。

傳代培養(yǎng)
2.在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，一定要提前將超凈工作臺(tái)或生物安全柜的紫外燈照射30分鐘以確保清潔。同時(shí)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，還需要用酒精擦拭消毒雙手。
2.將原有培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置放在顯微鏡下，仔細(xì)觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)，以確定是否需要進(jìn)一步進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2.1.采用酒精棉球擦拭操作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)瓶口火燒消毒；
2.用酒精棉球清潔操作臺(tái)，點(diǎn)亮酒精燈，讓培養(yǎng)瓶口經(jīng)過(guò)火燒消毒；
3.利用酒精棉球擦拭操作臺(tái)，將酒精燈點(diǎn)燃，用火燒消毒培養(yǎng)瓶口；
4.采用酒精棉球清潔操作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)瓶口進(jìn)行灼燒消毒；
5.用酒精棉球擦拭操作臺(tái)，將酒精燈點(diǎn)燃，對(duì)培養(yǎng)瓶口進(jìn)行火燒消毒；
2.倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，并保留貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。
2.在培養(yǎng)瓶中加入適量0.25%的胰酶，讓其剛好覆蓋住貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。然后擰緊瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放入37℃的培養(yǎng)箱中，保持5分鐘時(shí)間。在這段時(shí)間里，如果通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，可以看到細(xì)胞的突起會(huì)收回，并變成圓形。
2.取出培養(yǎng)瓶后，輕輕地?fù)u動(dòng)或吹打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從瓶壁上脫離，然后把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中。將離心管放在4℃的離心機(jī)中，以800rpm的速度離心5分鐘。
2.將離心管中的上清棄掉，然后把細(xì)胞懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中，接著把它移植到經(jīng)過(guò)多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。之后，將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。這樣，細(xì)胞便可以繼續(xù)分裂并傳代。

注意事項(xiàng)
1、進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，請(qǐng)注意以下事項(xiàng)：
1）在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，要特別注意無(wú)菌操作，并在采用之前對(duì)工具進(jìn)行高壓滅菌處理。
2）由于鼠胚原代培養(yǎng)時(shí)，因?yàn)榻M織較少，所以建議在冷光源體視顯微鏡下進(jìn)行操作；
3）原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程時(shí)間比較長(zhǎng)，最短需要一周以上的時(shí)間。如果在培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象，并且沒(méi)有漂浮物，可以排除污染，是很正常的現(xiàn)象，是由于細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中所釋放出來(lái)的。