qPCR實驗中，引物設(shè)計相當(dāng)關(guān)鍵，有時qPCR檢測結(jié)果不盡人意有可能是引物不合適。今天小編就來講講qPCR引物設(shè)計的原則和方法，希望能幫助各位小伙伴解決引物特異性差、擴增效率低等問題。

引物設(shè)計原則

1、引物長度一般為15-30bp，與模板的序列緊密互補，過長會導(dǎo)致其延伸溫度過高，不利于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

2、G+C含量一般為40%~60%，過高或過低都不利于寡核苷酸雙鏈解鏈反應(yīng)，可以按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計Tm值，Tm值接近72℃時復(fù)性條件最佳。

3、引物中四種堿基的分布最好是隨機的，避免出現(xiàn)聚嘌呤或聚嘧啶，尤其3’端不應(yīng)出現(xiàn)3個以上連續(xù)的G或C。

4、兩條引物之間及引物自身不應(yīng)存在互補序列，尤其要避免3’端的互補重疊防止引物二聚體的形成。

5、引物3’端不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。

6、引物5’端可以被修飾而不影響擴增的特異性。

7、引物3’端不要終止于密碼子的第3位。

8、引物設(shè)計最好跨內(nèi)含子設(shè)計。

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qPCR引物設(shè)計方法

第一步：基因查詢

以人SND1為例，在NCBI輸入基因名稱

第二步：找到CDS區(qū)

找到對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，點擊NM號

點擊CDS跳轉(zhuǎn)頁面底部，點擊FASTA獲取完整序列

第三步：引物設(shè)計

獲取完整CDS序列后點擊右邊Pick Primers

進(jìn)入該界面，紅框中的內(nèi)容根據(jù)設(shè)計需求修改，點擊頁面底部Get Primers獲得引物設(shè)計結(jié)果

得到設(shè)計結(jié)果后，可根據(jù)Tm值、CG含量初步篩選合適的引物，同時注意Self complementarity與Self 3' complementarity越小越好

除了上述方法，小伙伴還可以嘗試使用https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計，選擇物種后輸入NCBI結(jié)果中的ENST編碼即可獲得設(shè)計結(jié)果。

??以上就是qPCR引物設(shè)計的詳細(xì)步驟了，希望對各位小伙伴有所幫助~