引言

環(huán)狀RNA(circRNA)由下游剪接供體和上游剪接受體共價(jià)連接而成。其最重要的功能之一是通過(guò)結(jié)合RNA結(jié)合蛋白(RBP)發(fā)揮作用。然而，目前還沒有有效的算法來(lái)識(shí)別全基因組的circRNA和RBP相互作用。

為此，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種獨(dú)特的算法——circRIP，用于從RNA免疫沉淀測(cè)序(RIP-Seq)數(shù)據(jù)中識(shí)別circRNA與RBP互作。circRIP可以敏感、特異且系統(tǒng)地從RIP-Seq和eCLIP-seq數(shù)據(jù)中識(shí)別RBP和circRNA的相互作用，這可以造福于研究學(xué)者對(duì)circRNA結(jié)合RBP的功能探索。該成果發(fā)表在Briefings in Bioinformatics期刊上。

circRIP的概述

雖然RIP-Seq是一種檢測(cè)RBP和RNA相互作用的有效技術(shù)，但目前基于RIP-Seq的pipeline和算法是專門針對(duì)線性RNA設(shè)計(jì)的，不適用于circRNA。為了克服這一限制，作者開發(fā)了一種獨(dú)特的方法來(lái)檢測(cè)RBP和circRNA的結(jié)合，流程如圖1所示。

首先，根據(jù)之前廣泛使用的算法，對(duì)IP和RIP-Seq輸入樣本中的circRNAs進(jìn)行識(shí)別，并提取circRNA的計(jì)數(shù)[1]。使用每百萬(wàn)計(jì)數(shù)(CPM)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化circRNA的計(jì)數(shù)。接下來(lái)，將IP和Input的所有讀數(shù)(reads)映射到基因組中，以計(jì)數(shù)宿主基因的正向剪接點(diǎn)(forward spliced reads)。

然后計(jì)算在IP和Input中的circRNA表達(dá)倍數(shù)變化。為了評(píng)估抗體對(duì)circRNA的顯著富集程度，采用條件法檢測(cè)兩個(gè)泊松率(Poisson rates)之比來(lái)比較IP和Input樣本中檢測(cè)到circRNA的概率，并生成p值。

最后，結(jié)合circRNA表達(dá)的倍數(shù)變化和p值，估算IP中circRNA的富集程度。倍數(shù)變化≥2且P值<0.05的circRNA被認(rèn)為是IP富集的circRNA，也就是RIP結(jié)合的circRNA。否則，認(rèn)為是一個(gè)非富集的circRNA。綜上，作者研發(fā)了一個(gè)名為circRIP 的工具，可以通過(guò)github訪問(wèn)（https://github.com/bioinfolabwhu/circRIP）。??

circRIP的敏感性和特異性

作者構(gòu)建模擬了RIP-Seq數(shù)據(jù)，并測(cè)試了circRIP的敏感性和特異性。首先，從GENCODE和circBase中分別獲得人類基因組中所有線性轉(zhuǎn)錄本和circRNA的全長(zhǎng)序列。然后，隨機(jī)選取9000個(gè)線性轉(zhuǎn)錄本和1000個(gè)具有潛在表達(dá)的circRNA構(gòu)建模擬Input樣本。最后，隨機(jī)加入IP/Input和背景的倍數(shù)變化來(lái)模擬IP樣本。

作者將倍數(shù)變化隨機(jī)設(shè)為2-10，結(jié)果顯示>88%的富集circRNA被召回（AUC=0.96）。然后，通過(guò)分別設(shè)置2到10的倍數(shù)變化生成9個(gè)模擬數(shù)據(jù)集。通過(guò)應(yīng)用circRIP，觀察九個(gè)數(shù)據(jù)集的可靠性能：9個(gè)數(shù)據(jù)集的平均AUC為0.92。在數(shù)據(jù)集中觀察到最低的AUC為0.9，變化為2倍，表明circRIP性能穩(wěn)健。作者評(píng)估模擬數(shù)據(jù)集的假發(fā)現(xiàn)率(FDR)，結(jié)果表明，9個(gè)模擬數(shù)據(jù)集的FDR中位數(shù)為0.005，表明circRIP能夠以高靈敏度和特異性識(shí)別IP富集(RBP結(jié)合)的circRNA。并且circRIP比Clirc (AUC=0.76)具有顯著優(yōu)勢(shì)(AUC=0.94)。

基于RIP-Seq數(shù)據(jù)鑒定IGF2BP3結(jié)合的circRNA

IGF2BP3是調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯的m6A readers之一。為了研究IGF2BP3和circRNA之間的相互作用，作者使用circRIP分析了WM278細(xì)胞系中的IGF2BP3 RIP-Seq數(shù)據(jù)集?？偣茶b定出1285個(gè)circRNA，其中95個(gè)circRNA在IP樣本中顯著富集，表明它們與IGF2BP3存在潛在的相互作用。并且CDR1as是與IGF2BP3結(jié)合最多的富集的circRNA，這與之前RIP-PCR結(jié)果一致，表明了circRIP的可靠性。

作者還比較了IP樣本中IGF2BP3富集和非富集circRNA的reads計(jì)數(shù)（reads count），發(fā)現(xiàn)IP樣本中也檢測(cè)到大量來(lái)自非富集circRNA的reads，這表明在識(shí)別RBP結(jié)合circRNA時(shí)，消除這些circRNA是必要的，而circRIP也是這樣做的。并且circRIP可以識(shí)別出，富含IGF2BP3的circRNA的基因組分布主要來(lái)自外顯子，而不是內(nèi)含子和基因間區(qū)。

基于eCLIP數(shù)據(jù)識(shí)別數(shù)千個(gè)circRNA-RBP相互作用

作者從ENCODE項(xiàng)目(https://www.encodeproject.org/)中收集了119個(gè)K562細(xì)胞系RBPs和103個(gè)HepG2細(xì)胞系RBPs的eCLIP數(shù)據(jù)集，測(cè)試circRIP在eCLIP數(shù)據(jù)中的性能。

在鑒定出的10361個(gè)和5433個(gè)circRNA中，分別有2823和1333個(gè)circRNA在K562和HepG2細(xì)胞中被RBP顯著富集，這表明circRNA和RBP存在廣泛的相互作用(http://bib.oxfordjournals.org/)。作者比較了RBP在circRNA和線性RNA上的結(jié)合motif，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)motif在circRNA和線性RNA中顯著相似。隨機(jī)選取的驗(yàn)證結(jié)果與上述一致。

進(jìn)一步研究這些RBP結(jié)合circRNA的基因組分布發(fā)現(xiàn)，RBP AQR與大部分來(lái)自內(nèi)含子區(qū)的circRNA結(jié)合，而非外顯子區(qū)和基因間區(qū)。這顯示AQR可能在內(nèi)含子circRNA的生成中發(fā)揮重要作用。此外，此外，另一種RBP SF3B4也與更多內(nèi)含子circRNA結(jié)合，而其他RBP與外顯子circRNA結(jié)合更多一些。

為了揭示這些circRNA的潛在功能，作者進(jìn)行了通路分析驗(yàn)證這些RBP結(jié)合的circRNA在多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中富集。例如，AQR-結(jié)合的circRNA在有絲分裂細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)分解代謝、DNA損傷、mRNA代謝和組蛋白修飾中富集。DROSHA結(jié)合的circRNA參與蛋白質(zhì)分解代謝、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和mRNA代謝過(guò)程。這些結(jié)果表明，circRNA RBP相互作用在細(xì)胞系中普遍存在，并可能在病理或生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上兩個(gè)案例表明：circRIP運(yùn)用到研究circRNA的RBP功能上，具有靈敏、特異和適用性廣泛的優(yōu)點(diǎn)。

小結(jié)

作者基于RIP-Seq和eCLIP數(shù)據(jù)，研發(fā)了一種獨(dú)特的算法——circRIP，用于識(shí)別circRNA和RBP相互作用，并運(yùn)用了模擬實(shí)驗(yàn)和真實(shí)案例驗(yàn)證了circRIP的敏感性和特異性，彌補(bǔ)了目前尚無(wú)有效算法來(lái)識(shí)別circRNA 和RBP互作的缺陷。為研究circRNA的RBP功能增添了濃墨重彩的一筆。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/bib/bbac186

參考文獻(xiàn)：

[1] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 2013;495:333–8.

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