載體主要有病毒和非病毒兩大類，其中質(zhì)粒 DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。?

一、一個合格質(zhì)粒的組成要素 ?

復(fù)制起始位點(diǎn)：Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物 DNA 分子中只有一個復(fù)制起始點(diǎn)。

而真核生物 DNA 分 子有多個復(fù)制起始位點(diǎn)。

抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如 Amp+，Kan+。?

?多克隆位點(diǎn) MCS：克隆攜帶外源基因片段?

?P/E：啟動子/增強(qiáng)子?

?Terms：終止信號?

加 poly（A）信號可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用。?

二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜 ?

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒） 第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。 ?

（1）Ampr 水解 β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。?

?（2）Tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。?

（3）Camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。?

（4）Neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（卡那霉素衍生物）失活 ?

（5）Hygr 使潮霉素 β 失活。

?第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源 基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 ?

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片 段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。?

第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表 達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。?

? 啟動子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號 啟動子-促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 順序，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。?

? 增強(qiáng)子/沉默子-為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增 強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子-負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點(diǎn)，對于原核而言是 AUG （起始密碼）和 SD 序列。 轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。

結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一 個 AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。?

回答有人之前提出的一個問題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈，即 質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

三、關(guān)于載體的知識

1. 什么是載體 即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要 運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（Vector）?；蚬こ趟玫?Vector 實(shí)際上是 DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA。

2. 載體的分類 按功能分成： （1）克隆載體 都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來克隆和擴(kuò)增 DNA 片段（基因）的載體。（所以有時實(shí)驗時擴(kuò)增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）；（2）表達(dá)載體 具有克隆載體的基本元件（ori，Ampr，Mcs 等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的 DNA 順序的載體。 按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分： （1）原核載體 （2）真核載體 ?（3）穿梭載體（Shuttle Vector）：指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往 返兩種生物之間）。穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物 2 個復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。

3. 基因工程載體的 3 個特點(diǎn)： （一）都能獨(dú)立自主的復(fù)制：載體 DNA 分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如 MCS，插在其中的外源 DNA 片段，能被動的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。 （二）都能便利的加以檢測： 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板 上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。 （三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。

?4. 載體的選擇和制備： 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的 基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。 載體選擇主要考慮下述 3 點(diǎn)：?

? 【1】構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

? 【2】.載體的類型： （1）克隆載體的克隆能力-據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。?。如<10kb 選質(zhì)粒。 （2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型-原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。 （3）對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3 點(diǎn)： ①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌； ②用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時注意克服 4 個困難和閱讀框錯位； ③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。 ?

【3】載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。 選用質(zhì)粒（最常用）做載體的 4 點(diǎn)要求： ①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1-1.5 限 kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）； ②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10 個。 ③必需具備一個以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地； ④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。 無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目 的基因片段進(jìn)行連接。