HepG2人肝癌細(xì)胞在藥物作用下的相關(guān)研究中代謝酶始終保持穩(wěn)定，所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞同源，是體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)方面的理想的細(xì)胞系。

如何在HepG2細(xì)胞株上進(jìn)行基因敲除/基因敲入/基因突變也是各個(gè)課題組特別關(guān)心的問題！

經(jīng)過優(yōu)化，可以為客戶提供編輯效率高、結(jié)果穩(wěn)定、周期快速的細(xì)胞基因敲除的解決方案。

具體的HepG2細(xì)胞基因敲除/基因敲入/基因突變的技術(shù)流程如下：

整個(gè)技術(shù)流程中，構(gòu)建HepG2細(xì)胞基因編輯株的難點(diǎn)主要在于：

1. HepG2細(xì)胞克隆形成率低；

2. HepG2細(xì)胞克隆形成慢，周期被大大延長；

3. HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染后存活率低；

針對(duì)以上HepG2基因編輯幾個(gè)難點(diǎn)，我們進(jìn)行了研發(fā)，逐一提出解決方案，為快速獲得基因編輯成功的純合克隆。具體優(yōu)化包括以下方面：

1、HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)條件的優(yōu)化及克隆形成的優(yōu)化；

HepG2屬于比較好培養(yǎng)的細(xì)胞類型。參考ATCC推薦的培養(yǎng)條件，我們選擇的培養(yǎng)條件為EMSS+10% fetal bovine serum（專門優(yōu)化篩選批次）。EMSS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，我們自主研發(fā)配制，對(duì)滲透壓進(jìn)行了專門的優(yōu)化，大大提高了HepG2細(xì)胞增殖的速度，也使得HepG2的細(xì)胞的形態(tài)更好。

經(jīng)過細(xì)胞株的優(yōu)選， HepG2細(xì)胞增殖速度和克隆形成率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通細(xì)胞。

如培養(yǎng)的HepG2形態(tài)不太理想，可考慮添加1%NEAA，對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)會(huì)有所改善。正常情況下，HD加10%FBS的培養(yǎng)條件足矣。

2、HepG2細(xì)胞的最優(yōu)化的電轉(zhuǎn)效率和存活率；

采用IRUS-Free?技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，與病毒法相比，效率更高，周期更短，而且可以規(guī)避病毒重新復(fù)制的風(fēng)險(xiǎn)。

為提高轉(zhuǎn)染效率，我們優(yōu)化了電轉(zhuǎn)緩沖系統(tǒng)。加入了吸附劑，促進(jìn)DNA吸附到細(xì)胞的表面；加大的緩沖液的電阻，從而可以提供電轉(zhuǎn)的電壓，從而大幅度的提升了電轉(zhuǎn)的效率，是傳統(tǒng)緩沖系統(tǒng)的3-5倍的效率，達(dá)到80%。經(jīng)過優(yōu)化，細(xì)胞的存活率提升到90%，細(xì)胞的基因編輯的效率也得到了大幅提升。

3、HepG2細(xì)胞的快速克隆化條件優(yōu)化；

HepG2細(xì)胞喜抱團(tuán)生長，克隆形成困難。按照常規(guī)方法，測定細(xì)胞的克隆形成率不足3%，形成克隆體積非常小。同時(shí)，由于克隆團(tuán)并不呈規(guī)則的形狀，難以判斷是單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增所得還是多個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)生長形成的克隆團(tuán)。

HepG2細(xì)胞如此低的克隆形成能力，給獲得單克隆帶來了巨大困難。極限稀釋的方法下，要么選擇一次性設(shè)立不同梯度的細(xì)胞密度，接種大量孔板，或者反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的接種個(gè)數(shù)，總而言之，工作量相當(dāng)巨大。盡管如此，經(jīng)過漫長的3-4周的等待，仍然未必能獲得足夠多的用于鑒定的單個(gè)克隆。

HepG2細(xì)胞的單克隆化效率低，再加上基因定點(diǎn)突變效率遠(yuǎn)低于基因敲除效率，兩種因素疊加導(dǎo)致拿到突變純合子的概率極低。

ClonePlus?技術(shù)采用專有的膠體表面處理，HepG2細(xì)胞株的克隆率超過95%，可以輕松進(jìn)行克隆分離和克隆PCR鑒定，大幅提升HepG2細(xì)胞的鑒定陽性率。

ClonePlus?技術(shù)，HepG2的細(xì)胞克隆形成能夠達(dá)到95%以上，而且克隆形成的時(shí)間可縮短到1-2周的時(shí)間，大大壓縮了整個(gè)單克隆生長的時(shí)間周期，贏得寶貴的時(shí)間。

ClonePlus?技術(shù)：是Cas9X?技術(shù)平臺(tái)研發(fā)的專有高效細(xì)胞敲除技術(shù)，主要通過高通量電轉(zhuǎn)系統(tǒng)和高通量的克隆分選技術(shù)結(jié)合，獲得基因編輯的單細(xì)胞，其克隆形成率可以達(dá)98%，就算是克隆形成率低的細(xì)胞株也能獲得敲除單克隆，針對(duì)懸浮細(xì)胞也有更高的單克隆形成率。

VIRUS-Free?技術(shù)：是一種利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建和篩選的技術(shù)，以替代慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的技術(shù)。其載體中包括了轉(zhuǎn)座子的識(shí)別區(qū)域，能將目的片段從載體上或者BAC分子上切割下來形成一個(gè)小環(huán)結(jié)構(gòu)，并在基因組里面的固定序列位置進(jìn)行插入，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)。目前已經(jīng)在CAR-T細(xì)胞治療中得到較多的臨床應(yīng)用，并充分體現(xiàn)出其：低成本、高效率、基因表達(dá)穩(wěn)定的特點(diǎn)。

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