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石蠟切片免疫熒光雙標(biāo)-TSA

2022-11-12 17:58 作者:云柏奧-少峰 0人讀過(guò) | 我要投稿

之前發(fā)過(guò)幾期免疫熒光的推文，介紹了一些基本的原理和一些實(shí)驗(yàn)步驟，不過(guò)之前發(fā)的是熒光標(biāo)記二抗的步驟，今天再發(fā)一期基于TSA技術(shù)的石蠟切片免疫熒光雙標(biāo)?；仡櫿?qǐng)點(diǎn)擊：石蠟切片免疫熒光多標(biāo)

01基本原理?

酪酰胺信號(hào)放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過(guò)氧化酶（HRP）對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法。

此技術(shù)的主要原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)（即熒光標(biāo)記的酪胺鹽在HRP催化H2O2 下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)），產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng)，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基（包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基）結(jié)合，在抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的熒光素沉積，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。還可以通過(guò)多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒馊旧?/p>

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。

然后微波處理，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測(cè)結(jié)果。

02優(yōu)勢(shì)?

首先當(dāng)然是信號(hào)放大啦，TSA技術(shù)可以用于檢測(cè)用傳統(tǒng)方法無(wú)法檢出的低豐度靶標(biāo)?；诶阴０返男盘?hào)放大技術(shù)能夠提供極強(qiáng)的敏感度、檢測(cè)極微量的目的抗原。
其次是省心，由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，同源異源都一個(gè)步驟，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。但是節(jié)約不了時(shí)間，每個(gè)一抗都是要4°過(guò)夜孵育的。
再次是能大大節(jié)約一抗，因?yàn)槭切盘?hào)放大技術(shù)，為避免背景熒光過(guò)強(qiáng)，所以一抗稀釋比是常規(guī)建議稀釋濃度的5-10倍。
最后是能實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒鈽?biāo)記，可同時(shí)進(jìn)行五個(gè)顏色通道以上，這是傳統(tǒng)間接熒光法染色和顯色法多重免疫組化所做不到的。這種方法能真實(shí)反映關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況和相互之間的關(guān)系，從而極大地節(jié)約珍貴的樣品。