寫在前面

????????今天推薦的是由名古屋大學環(huán)境醫(yī)學研究所團隊在2015年12月15日發(fā)表于Cell Reports（IF：7.985，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Chikahide Masutani教授，研究表明USP7可以獨立于細胞周期抑制氧化應(yīng)激誘導的PCNA泛素化和突變。

研究背景

????????PCNA（增殖的細胞核抗原）翻譯后的單泛素化是調(diào)控DNA跨損傷復制（TLS）通路的重要事件。單泛素化的PCNA可激活具有致突變性的DNA聚合酶，因此嚴格調(diào)控PCNA的單泛素化水平是避免不必要突變的關(guān)鍵。在人類細胞中，E2-泛素結(jié)合酶RAD6和E3泛素連接酶RAD18在PCNA的泛素化中起著重要作用。

????????去泛素化酶（DUB）對于調(diào)節(jié)細胞中蛋白的泛素化水平有著關(guān)鍵作用。USP1的下調(diào)提高了PCNA的單泛素化水平，這是DNA復制時受到UV照射后產(chǎn)生的。相比之下，氧化應(yīng)激誘導的PCNA單泛素化不受USP1調(diào)控。此外，最近的許多報告表明，USP7在DNA損傷應(yīng)答中起作用。USP7通過調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與氧化DNA損傷的修復。USP7還與PCNA泛素化系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。研究表明，USP7通過調(diào)節(jié)Pol?的穩(wěn)定性間接調(diào)控UV誘導的PCNA單泛素化。

摘要部分

????????在這項研究中，作者使用體外檢測系統(tǒng)鑒定了USP7為單泛素化PCNA的去泛素化酶。研究發(fā)現(xiàn)，USP7和USP1的下調(diào)以不同的方式提高了UV照射和氧化應(yīng)激誘導的PCNA單泛素化水平。重要的是，USP1和USP7的下調(diào)分別促進了UV誘導和H2O2誘導的DNA突變，而RAD18的下調(diào)則消除了這兩種作用。這些結(jié)果表明，USP7通過將單泛素化的PCNA去泛素化來調(diào)控人類細胞中DNA損傷誘導的突變。

研究內(nèi)容

1.USP7在體外介導單泛素化的PCNA去泛素化

????????為闡明PCNA單泛素化的調(diào)控機制，作者研究了HeLa細胞提取物中可在體外調(diào)控泛素化的蛋白質(zhì)因子。最終，作者確定了一個140 kDa的調(diào)控泛素化的蛋白。質(zhì)譜（MS）分析顯示該多肽為泛素特異性蛋白酶USP7，USP7可以介導單泛素化的PCNA去泛素化。另外，沒有其他蛋白質(zhì)與USP7被共同純化出來。因此，作者認為USP7在體外介導單泛素化的PCNA去泛素化是其固有功能，不需要輔助因子。

研究結(jié)論：USP7可獨立行使其去泛素化功能，它可以去除單泛素化PCNA上的泛素分子。

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2.USP7可顯著抑制UV或H2O2誘導的PCNA單泛素化

????????實驗發(fā)現(xiàn)，對USP1的抑制提高了UV誘導或未輻射細胞中PCNA的單泛素化水平。在USP7被抑制的細胞中PCNA的單泛素化水平也明顯高于對照細胞，但不如USP1被抑制的效果明顯。研究表明，在UV照射早期和未照射狀態(tài)下，USP1在抑制PCNA單泛素化的過程中起著重要作用，并且USP7也發(fā)揮一定的定量調(diào)控作用。此外，即使沒有USP1和USP7，UV誘導的PCNA單泛素化也在24h下降，這表明細胞具有清除單泛素化PCNA的其他機制。? ? ?

????????H2O2處理后，PCNA的單泛素化水平立即增加，15-30min后達到最大值，2h內(nèi)幾乎消失。H2O2以劑量依賴的方式促進PCNA的單泛素化。值得注意的是，對USP7的抑制比抑制USP1在更大程度上促進了H2O2誘導的PCNA單泛素化。此外，在WI38VA13、HeLa等多種細胞系中抑制USP7均提升了H2O2誘導的PCNA單泛素化水平。

????????在表達K164R突變的PCNA-HA細胞中，作者未觀察到USP7被抑制后H2O2誘導的單泛素化增加。此外，共同抑制RAD18與PCNA后，抑制USP7對于促進PCNA單泛素化的效果顯著降低。這些結(jié)果表明，USP7調(diào)控H2O2誘導的PCNA單泛素化是以RAD18依賴的方式在164位賴氨酸上發(fā)生的。

研究結(jié)論：USP1和USP7均有助于抑制UV誘導的PCNA單泛素化，其中USP1起主要作用。而USP7還具有抑制H2O2誘導的PCNA單泛素化的功能。? ?

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3.USP7具有獨立于細胞周期的抑制PCNA單泛素化的功能

????????接下來作者研究了USP7在不同細胞周期對PCNA泛素化的調(diào)控。實驗顯示，對USP7或USP1的抑制并沒有改變釋放后的同步效率和細胞周期進程。另外，無論UV或H2O2處理，對照組和USP7抑制的細胞在釋放后8h的USP1蛋白水平均低于16或20h，這與先前報道的USP1在G0/G1期下調(diào)一致。另一方面，在對照組或USP1被抑制的細胞中，USP7蛋白水平在整個細胞周期中都沒有變化。? ? ?

????????對USP1的抑制在進入細胞周期后的16和20 h促進了UV誘導的PCNA單泛素化，但在8 h則沒有。這表明USP1抑制了UV誘導的DNA復制中的PCNA單泛素化。此外，進入細胞周期后的8、16或20 h，USP7對UV誘導的PCNA單泛素化沒有作用。

????????進一步研究表明，對USP1的抑制在進入細胞周期后的16和20 h比8 h在更大程度上提升了H2O2誘導的PCNA單泛素化水平。與之相反，對USP7的抑制在三個時間點均促進了H2O2誘導的PCNA單泛素化。

研究結(jié)論：USP1對于抑制復制偶聯(lián)中的PCNA單泛素化至關(guān)重要，而USP7可獨立于細胞周期事件抑制PCNA的單泛素化。

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4.USP1和USP7在抑制UV和H2O2誘導的突變中有獨特作用? ? ?

????????實驗顯示，抑制USP1基本不影響細胞對UV的敏感性。另一方面，USP7通過穩(wěn)定UVSSA促進了UV誘導的DNA損傷的修復，且USP7與UVSSA的敲低也提高了細胞對UV的敏感性。此外，USP7和/或USP1的抑制不影響細胞對H2O2處理的敏感性。? ? ?

????????在supF突變分析中，對USP1的抑制促進了UV誘導的突變。與此相一致，UV照射后，USP1被抑制的細胞中的突變頻率增加，而共抑制RAD18抑制了這種增加。這些表明該突變是以PCNA泛素化的方式誘導的。對USP7的抑制也可能增加UV誘導的突變，但并不明顯。

????????相比之下，兩個獨立的siRNA對USP7的敲低顯著提高了H2O2誘導的HPRT突變率。而RAD18的共抑制降低了突變頻率的增加，表明該突變也是以PCNA泛素化的方式誘導的。無論USP7處于何種狀態(tài)，抑制USP1都不會增加H2O2誘導的突變頻率，這證實了其在H2O2誘導的突變中的次要作用。

?研究結(jié)論：USP1可以通過控制PCNA泛素化來抑制UV誘導的突變。另一方面，USP7以獨立于USP1的方式來調(diào)控PCNA泛素化，從而在不依賴細胞周期的過程中抑制H2O2誘導的突變。

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結(jié)論與討論

????????作者發(fā)現(xiàn)USP1和USP7分別顯著抑制了UV和H2O2誘導的PCNA單泛素化和DNA突變，這表明細胞可以根據(jù)DNA損傷的類型和細胞周期選擇合適的DUB機制。此外，即使在USP1和USP7均被抑制的細胞中，H2O2和UV誘導的PCNA單泛素化最終也消失了，這表明細胞還有其他機制來清除泛素化的PCNA。因此，未來的研究應(yīng)解決多個DUBs在DNA損傷耐受下是如何協(xié)同調(diào)控的。

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Thank you!

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原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.11.014