一種自組裝納米顆粒：對開發(fā)熱穩(wěn)定疫苗候選物的意義

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關(guān)鍵詞：自組裝納米顆粒 ???????納米疫苗 ???????增強(qiáng)免疫原性

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摘要

有效控制病毒感染有賴于疫苗技術(shù)的不斷發(fā)展。納米粒子（NP）抗原由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而具有高度的免疫原性，使其成為呈現(xiàn)可溶性抗原的分子支架。在這里，病毒靶點(diǎn)（113-354aa）基因融合到mi3的N末端，mi3是一種由60個(gè)亞基自組裝成的納米顆粒蛋白。通過透射電子顯微鏡，可以觀察到形成了在mi3的N端融合插入了354個(gè)aa的蛋白。除此之外，如動(dòng)態(tài)光散射所示，病毒基因在NP上面顯示。NP可以在室溫條件下長期儲(chǔ)存并表現(xiàn)出完美的穩(wěn)定性。此外，SP-E2-mi3可以上調(diào)標(biāo)記分子和免疫刺激細(xì)胞因子來增強(qiáng)樹突細(xì)胞（DC）中抗原的攝取和成熟。重要的是，在小鼠模型中，與單體E2蛋白相比，針對豬瘟病毒（CSFV）的SP-E2-mi3納米疫苗顯著改善了豬瘟特異性中和抗體(NAbs)和細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子（IFN-r和IL-4)。特別的，針對CSFV石門和HZ-08菌株的NAb滴度增加了10倍以上，改善了NAb應(yīng)答，表明針對不同基因型的交叉保護(hù)更好。總之，這種基于結(jié)構(gòu)的自組裝NP可以作為提高亞單位疫苗對新出現(xiàn)病原體的效力提供了一個(gè)有吸引力的平臺(tái)。

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1 引言

在越來越多的病例中，基于滅活或者減毒病原體的傳統(tǒng)疫苗無法有效控制新出現(xiàn)的傳染病。盡管它們可能在宿主中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，其特征是有效的T細(xì)胞、B細(xì)胞應(yīng)答和記憶免疫，在疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用中使用潛在的具有致病性的活微生物導(dǎo)致了對安全性的擔(dān)憂，從而限制了其應(yīng)用。最近世界范圍內(nèi)出現(xiàn)的重要流行性疾病進(jìn)一步增加了對旨在提高免疫原性和安全性的新型疫苗策略的需求。因此，考慮到與傳統(tǒng)疫苗策略相比的優(yōu)勢，包括缺乏毒力因子，易產(chǎn)性、生物安全性和DIVA（感染和接種動(dòng)物之間的區(qū)別），基因工程亞單位疫苗已經(jīng)越來越流行。

通常，病原免疫原性在很大程度上受抗原的物理化學(xué)性質(zhì)影響。具有優(yōu)異免疫原性的常規(guī)滅活或減毒病原體可為改進(jìn)提供關(guān)鍵參考，包括，a.減毒病原體的復(fù)制效率、b.高度重復(fù)和有序的表面抗原陣列、c.顆?？乖男再|(zhì)以及d.同時(shí)激活先天免疫和適應(yīng)性免疫的能力。

基于這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出多種方法來增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫原性，其中包括通過偶聯(lián)到大蛋白載體或佐劑來增加抗原的大小、抗原多聚化和顆粒載體上高度重復(fù)抗原的表面展示。

生物活性蛋白質(zhì)分子相互作用并自行排列，形成有序的結(jié)構(gòu)，與自然狀態(tài)下的功能密切相關(guān)。天然自組裝蛋白納米顆粒（SAPN）在病毒衍生的蛋白質(zhì)中有很好的表現(xiàn)，如煙草花葉病毒（TMV）衣殼和乙肝病毒（HBV）表面抗原（HBsAg)。此外，早在1981年，德雷克斯勒就首次提出了使用自組裝蛋白質(zhì)作為單體構(gòu)建塊的蛋白質(zhì)分子工程。從那時(shí)起，通過模擬一些自然結(jié)構(gòu)衍生出的自組裝概念使得科學(xué)家能夠構(gòu)建各種自組裝納米材料，用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如疫苗、藥物輸送和醫(yī)學(xué)成像。SAPN通常由多種高度重復(fù)的基序組成，可用于外源表位或蛋白質(zhì)整合。這些嵌入的分子表面顯示在組裝的顆粒上。這些嵌合SAPN是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中抗原表位和蛋白質(zhì)遞送的理想載體。SAPN上外來抗原的空間排列類似于自然病原體上的病原體相關(guān)分子模式（PAMP），其特征在于高抗原密度和高度有序的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)抗原和BCR之間的交聯(lián)反應(yīng)。這種多重相互作用對于激發(fā)免疫反應(yīng)至關(guān)重要，這為提高亞單位疫苗的免疫原性提供了一種替代方案。

對于疫苗遞送，基于NP的疫苗在誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫和先天免疫方面方面比亞單位可溶性抗原具有許多改進(jìn)的特性。納米尺寸的顆?？梢愿纳艱C中的抗原吞噬和內(nèi)化，作為最強(qiáng)大的APC，其在啟動(dòng)有效免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，相較于可溶性抗原，APC更喜歡通過內(nèi)吞作用內(nèi)化NP。與通常MHCII類途徑呈現(xiàn)的可溶性蛋白抗原不同，NP抗原內(nèi)化到APC中促進(jìn)了通過MHCII和MHCI類途徑的交叉呈現(xiàn)和交叉啟動(dòng)，隨后增強(qiáng)了CD8+CTL免疫應(yīng)答。此外，NP本身也作為遞送系統(tǒng)發(fā)揮輔助作用。除了增強(qiáng)抗原內(nèi)化和呈遞外，NP可以促進(jìn)先天免疫的激活、免疫刺激性細(xì)胞因子的分泌及DC的成熟和遷移，這反過來促進(jìn)免疫反應(yīng)的初始化。

VLPs（類病毒顆粒）是一種自組裝NP，在疫苗開發(fā)中取得巨大成功，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)減毒或滅活疫苗的缺點(diǎn)。它們僅與選定的病毒蛋白組裝，并緊密模擬天然病毒顆粒的三維結(jié)構(gòu)，從而使得它們成為非傳染性但高度免疫原性的抗原?；赩LP的疫苗很好的證明了這一點(diǎn)，包括針對乙型肝炎、宮頸癌和戊型肝炎的疫苗。在針對不同感染的臨床試驗(yàn)階段，對越來越多的基于VLP疫苗的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評估。然而，大多數(shù)病毒保護(hù)抗原，如豬瘟病毒E2，不能天然形成VLP，限制了疫苗的效力，也導(dǎo)致了對SAPN顆粒疫苗的迫切需求。

豬瘟的出現(xiàn)和再次出現(xiàn)給養(yǎng)豬業(yè)帶來了持續(xù)的威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管毫無疑問，減毒疫苗可以提供對豬瘟病毒的全面保護(hù)，但它不能提供DIVA特性，從而阻礙豬瘟的根除。由于E2糖蛋白在免疫動(dòng)物中誘導(dǎo)中和抗體，因此被認(rèn)為是亞單位疫苗開發(fā)的主要靶點(diǎn)?；贓2可溶性的疫苗可以誘導(dǎo)有效的中和抗體，但是需要多次接種才能獲得足夠的保護(hù)，因此尚未在CSF流行地區(qū)成功推廣。因此需要改進(jìn)以提高亞單位疫苗的保護(hù)效力，基于NP的遞送技術(shù)可能提供一種強(qiáng)大的替代工具。

通常，廣泛的靶抗原通過基因工程融合表達(dá)或化學(xué)偶聯(lián)與NP連接，并顯示在表面上。由于偶聯(lián)位點(diǎn)的異質(zhì)性和抗原的物理化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致化學(xué)偶聯(lián)具有挑戰(zhàn)性。PH、離子強(qiáng)度、溫度、抗原疏水性和對化學(xué)修飾的敏感性可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合效率的變化，從而損害疫苗抗原的穩(wěn)定性和免疫原性。基因融合是容易的去操縱在NP外表面，因此通過高度有序、對稱的結(jié)構(gòu)抗原，并在宿主免疫系統(tǒng)中重復(fù)排列，從而增強(qiáng)這種弱免疫原的抗原呈遞。當(dāng)涉及基于NP的疫苗設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)考慮四個(gè)關(guān)鍵因素：插入大小（抗原/表位大?。P形成能力、NP穩(wěn)定性和抗原/表位的表面展示，它們與NP疫苗的免疫效力密切相關(guān)。先前的研究表明，基于二十面體納米籠的計(jì)算設(shè)計(jì)，i301和mi3能夠自行排列，自發(fā)形成高度有序的60亞基的二十面體，這是基于NP的新型疫苗設(shè)計(jì)的一種有前途的替代方案。然而，包括插入能力和免疫效力在內(nèi)的許多問題仍有待驗(yàn)證。

在本研究中，我們專注于通過基于NP的技術(shù)提高亞單位疫苗的保護(hù)效力。為此，開發(fā)了自組裝納米顆粒（mi3）,并將其表征為疫苗遞送支架。將不同大小的病毒靶蛋白基因融合到mi3的N末端。插入不會(huì)損害NP的形成，并且通過DLS證明靶蛋白存在于mi3 NP的表面。然后，我們在體外研究了這種SP-E2-mi3對APC的佐劑作用，以評估其在疫苗開發(fā)中的潛力。此外，針對CSFV的基于SP-E2-mi3 NP的新型納米疫苗被初步生產(chǎn)并評估了其在小鼠中引發(fā)的有效免疫應(yīng)答情況。

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2.材料與方法

2.1?克隆

合成mi3（GenBank AXF54357.1）的DNA序列，并將其克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac HTA(Invitrogen,Carlsbd,CA,USA)中，以生成pFastBac-mi3。將包括GP5ab(113aa)、Cap(42-234aa,GenBank MH920578.1)、sfGFP(249aa,GenBank ASL68970.1)和CSF SP-E2的靶蛋白分別引入mi3上游的pFastBac-mi3中。柔性接頭（GGS）4結(jié)合在靶蛋白和mi3之間，以避免空間位阻并允許適當(dāng)折疊。所有的質(zhì)粒采用標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建，并通過DNA測序進(jìn)行驗(yàn)證。隨后按照制造商的說明通過Tn7轉(zhuǎn)座子、桿狀病毒提取和轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒。

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2.2?重組蛋白的表達(dá)和純化

在500ml細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶中培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞，并調(diào)整至每毫升2-2.5x106個(gè)細(xì)胞，隨后，用重組桿狀病毒接種細(xì)胞。在27°中培養(yǎng)4天，通過5000rpm離心20分鐘收獲細(xì)胞顆粒，并用1mM苯甲磺酰氟（PMSF）的PBS（ph 7.4）中，然后通過超聲裂解細(xì)胞顆粒，收集含有靶蛋白的上清液并將其裝載到2ml瓊脂糖樹脂上（yeasen中國）。用20mM咪唑的PBS緩沖液洗雜，用含有400mM的咪唑的PBS進(jìn)行洗脫靶蛋白。隨后將得到的純化蛋白用12% SDS-PAGE進(jìn)行分析驗(yàn)證，并通過BCA蛋白定量試劑盒（Vazmye 中國）進(jìn)行定量，并儲(chǔ)存在4°直到時(shí)用。

2.3. NP自組裝的物理化學(xué)條件和性質(zhì)

在16℃條件下制備NP組裝溶液（200mM Nacl，50mM Tris,0.1%吐溫-20，ph 8.0）,使用管狀透析設(shè)備（Tube- O-DIALYZER?, Sangon Biotech, Shanghai, China）。通過透視電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行負(fù)染觀察NP的形成。簡言之，將純化的靶蛋白-mi3融合蛋白置于銅網(wǎng)上，然后使用2%PTA溶液（PH 6.8）進(jìn)行60s的負(fù)染色。在80KV加速電壓下，用JEM1010透射電子顯微鏡（JEOL Ltd., Tokyo, Japan）檢測負(fù)染樣品，然后通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量NP的流體動(dòng)力學(xué)直徑和尺寸分布。

2.4.熱穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性評估

為了評估不同條件下的熱穩(wěn)定性，在4、25、37、50或者65℃下孵育SP-E2-mi3NPs 儲(chǔ)備。然后，將樣品冷卻至4℃，然后用熱循環(huán)儀將其加熱10分鐘。通過15000g 30min離心移除聚合物。通過SDS-PAGE分析上清液并通過密度測定法測定。在四度的可溶性定義為100%。

對于長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性分析，無菌過濾sp-E2-mi3 NP的儲(chǔ)存并在室溫下孵育（25℃）。在指定的時(shí)間點(diǎn)，將樣品離心去除聚集體，并進(jìn)行TEM拍攝評估NP 的完整性分析。Image J軟件（Bethesda, MD, USA）用于計(jì)算NP的數(shù)量。

2.5. 鼠源骨髓細(xì)胞的生成和驗(yàn)證

用RPMI1640從C576BL雄性小鼠的骨髓中獲得BMDC，并洗滌兩次。紅細(xì)胞在紅細(xì)胞裂解緩沖液（Beyotime,中國）中裂解，并收集剩余細(xì)胞。隨后，將細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞每孔的密度用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含有10%FBS、10ng/ml 小鼠IL-4）重新懸浮在6孔細(xì)胞板中。培養(yǎng)基每間隔2天更換一次。培養(yǎng)7天后，大多數(shù)細(xì)胞已獲得典型的樹突形態(tài)。通過流式細(xì)胞術(shù)測定純度后，這些細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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2.6. 細(xì)胞攝取

為了驗(yàn)證SP-E2或者SP-E2-mi3 NPs的最佳濃度，以便進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，按照試驗(yàn)手冊描述，通過MTT細(xì)胞活性測定（Thermo Scientific Inc.）評估這些蛋白質(zhì)對BM-DC的細(xì)胞毒性作用。

FITC標(biāo)記的SP-E2(FITC-SP-E2)和SP-E2-mi3 NP（FITC-SP-E2-mi3 NP），根據(jù)用戶手冊使用商業(yè)化試劑盒（Sangon, China）制備。通過以下步驟確定BM-DCs對于SP-E2-mi3 NP的內(nèi)化。加入100uM FITC-SP-E2或者FITC-SP-E2-mi3 NP并孵育2小時(shí)。在通過共聚焦激光掃描顯微鏡IX81-FV1000 (Olympus)收集熒光圖像之前，用75nMLysoTracker Red DND-99 probe (Yeasen, Shanghai)對后期溶酶體染色30分鐘。

對于流式細(xì)胞術(shù)，用100um sp-E2或者sp-E2-mi3 NP刺激培養(yǎng)7天的細(xì)胞，PBS作為對照，孵育24小時(shí)后，洗滌細(xì)胞并用胰蛋白酶制備成細(xì)胞懸液。隨后，用熒光標(biāo)記的抗小鼠單克隆抗體PE-CD11c或FITC-CD40（eBioscience, CA, USA）對細(xì)胞進(jìn)行染色。用PBS沖洗以去除未結(jié)合的抗體后，然后在BD FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, NJ, USA)流式儀器上分析細(xì)胞。

2.7.BM-DCs標(biāo)記基因和細(xì)胞因子表達(dá)的分析

研究SP-E2-mi3 NP對BMDC成熟和細(xì)胞因子表達(dá)的影響。在使用100um的SP-E2、mi3 NP或者SP-E2-mi3 NP 4小時(shí)后，根據(jù)制造商的說明，使用Easy RNA Kit (Zhejiang Easy-Do Biotech CO., LTD)試劑盒提取BMDC的總RNA。另外按照制造商所述，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) 進(jìn)行熒光定量PCR（Q PCR），所用引物為先前報(bào)道的靶序列設(shè)計(jì)的，如表1所示，actin作為內(nèi)部對照，使用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。

2.8.免疫

6周齡雌性BALB/C被隨機(jī)分到四組，每組5只，A組和B組分別皮下接種25ug或者40ug SP-E2-mi3 NP，C組接種40ug SP-E2，PBS免疫D組作為陰性對照。通過相同劑量或者給藥途徑以14dpi進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在不同的時(shí)間點(diǎn)，立即采集血清樣本以進(jìn)一步檢測豬瘟特異性抗體和中和抗體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序由浙江大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)監(jiān)督和批準(zhǔn)。

2.9.血清學(xué)檢測

對0、7、21和28dpi的小鼠血清進(jìn)行間接ELISA以評估CSFV E2特異性抗體水平。簡言之，用100ul/孔濃度為50nM的SP-E2或者mi3蛋白預(yù)涂ELISA板子(Corning, USA)，并在4℃過夜。用含有0.05%吐溫-20（PBST）的PBS洗滌三次后。在37℃下用PBST中5%的脫脂牛奶封閉平板2小時(shí)。隨后，加入小鼠血清樣本（在PBST中稀釋，1:500），并在37℃下孵育1小時(shí)。用PBST洗滌三次后，將平板與100ul HRP結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(在PBST中稀釋，1:5000，Sangon, China)，在37℃孵育1小時(shí)。用PBST沖洗以去除未結(jié)合的抗體后，在室溫下加入100ul四甲基聯(lián)苯胺（TMB）10分鐘，然后加入50ul 2M H2SO4停止反應(yīng)。使用微板讀取器（Biotek, USA）讀取450nm處的吸光度。根據(jù)其他相關(guān)研究，在標(biāo)準(zhǔn)中和試驗(yàn)中測試了中和抗體。

2.10.細(xì)胞因子檢測

根據(jù)制造商的說明，使用IL-4和IFN-r檢測試劑盒（Boster, Wuhan, China）檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平。14和28dpi的血清用于評估IFN-r和IL-4應(yīng)答。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定IFN-r和IL-4濃度。

2.11.統(tǒng)計(jì)分析

當(dāng)兩組進(jìn)行比較時(shí)，通過 Student's t-test檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，或通過兩組以上的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1. qPCR使用的引物如下

引物

序列（5’—3’）

GenBank ID

actin

F: GGAGGGGGTTGAGGTGTT

R: GTGTGCACTTTTATTGGTCTCAA

NM_007393.5

MHC II

F: CTGTCTGGATGCTTCCTGAGTTT

R: TCAGCTATGTTTTGCAGTCCACC

NM_207105.3

CD80

F: CCCCAGAAGACCCTCCTGATAG

R: CGAAGGTAAGGCTGTTGTTTG

NM_009855.2

CD86

F: GCCGTGCCCATTTACAAAGGCTCAA

R: TGTTACATTCTGAGCCAGTTTTATT

NM_019388.3

TNF-a

F: GCCTCTTCTCATTCCTGCTT

R: TGGGAACTTCTCATCCCTTTG

NM_013693.3

IL-6

F: GTTCTCTGGGAAATCGTGGA

R: TCCAGTTTGGTAGCATCCATC ?

DQ788722.1

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3.?結(jié)果

3.1.用mi3 NP成功組裝不同大小的病毒蛋白

為了研究mi3的N端插入容量對NP形成的影響，通過克隆含有C端12xhis的靶蛋白PRRSV GP5m（113aa）、PCV2 Cap（192aa）、sfGFP（249aa）和CSFV SP-E2（354aa）構(gòu)建了幾個(gè)質(zhì)粒（圖a）。融合蛋白在sf9細(xì)胞中成功過表達(dá)，并在天然條件下使用金屬親和層析純化。如SDS-PAGE分析所描述的，所有蛋白條帶均與預(yù)測大小一致，純度超過90%（圖b），接下來，用NP組裝溶液代替緩沖液進(jìn)行NP組裝，并通過透射電子顯微鏡（TEM）檢查。結(jié)果表明，融合蛋白mi3、GP5m-mi3、Cap-mi3、sfGFP-i3和SP-E2-mi3可以自組裝成均勻的NP，其直徑約為25-35nm圖C。值得注意的是，NP的直徑隨著插入的蛋白質(zhì)的大小而增加，范圍從113aa-354aa。因此，我們推測，根據(jù)其空間構(gòu)象，mi3 N末端融合靶很可能位于NP表面（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，編號(hào)：5KP9，圖D），在這里，對于這四種NP，我們的靶抗原顯示在NP的表面上。

3.2.DLS表征NP

為了驗(yàn)證顆粒與抗原的組裝，DLS用于進(jìn)一步表征這些NP的流體動(dòng)力學(xué)和zeta電位。從圖A-C中可以清楚的看出，SP-E2-mi3 NP插入354aa的平均直徑37.1nm，其次是sfGFP-mi3 NP插入249aa的31.4nm，而mi3 NP的平均直徑僅為27.3nm。這一結(jié)果支持了之前的發(fā)現(xiàn)，即mi3 N-末端融合主要延伸到NP外，導(dǎo)致流體動(dòng)力學(xué)尺寸顯著增加。此外，源自mi3 N末端融合的spycatcher 的NP可以與spytag（spycatcher的配體）有效結(jié)合，這表明mi3 N末端融合靶蛋白位于NP的表面。

Zeta 電位都是NP表征的另一個(gè)重要指標(biāo)。Zeta電位的絕對值越大，NPs的膠體系統(tǒng)越穩(wěn)定。如圖D所示，sfGFP-mi3 NPs的電位為-13.6 mv，其次是SP-E2-mi3 NP的電位為-16mv，它們略低于mi3 NP的-22.7mv。結(jié)果表明，N末端融合的SP-E2不會(huì)顯著改變mi3-NP在NP組裝緩沖液中的穩(wěn)定性。

3.3.SP-E2-mi3 NP表現(xiàn)出完美的熱穩(wěn)定性和長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性

對于顆粒組裝的有效候選疫苗，考慮到成本和現(xiàn)場效力，確定穩(wěn)定性至關(guān)重要。為了測試納米顆粒的熱穩(wěn)定性，SP-E2-mi3納米顆粒在25-65℃溫度下，組裝緩沖液中孵育1小時(shí)。將樣品離心以去除聚集體，并通過密度測定法對上清液中的可溶性部分進(jìn)行定量。加熱至50℃導(dǎo)致28%的SP-E2-mi3 NPs 聚集損失，最高65℃，至少45%的NP保持可溶形式。

除了熱穩(wěn)定性，我們還評估了顆粒在室溫下的穩(wěn)定性項(xiàng)。2、4、6周后，通過TEM值分析NP的完整性和數(shù)量。結(jié)果顯示，完整的SP-E2-mi3 NP的百分比在四周內(nèi)超過了80%，在6周時(shí)達(dá)到了50%，圖3B。此外，SP-E2-mi3 NP的大小分布也很窄，表明其對疫苗接種具有生物活性，圖3C。總之，SP-E2-mi3表現(xiàn)出完美的粒度均勻性和長期穩(wěn)定性。

3.4.SP-E2-mi3 NP促進(jìn)骨髓樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞攝取

作為最關(guān)鍵和最有效的APC，DC已經(jīng)進(jìn)化為識(shí)別和吞噬顆粒和重復(fù)結(jié)構(gòu)，如NP以增強(qiáng)T細(xì)胞啟動(dòng)和免疫反應(yīng)。在重組小鼠GM-CSF和IL-4的存在下，從骨髓原始細(xì)胞中產(chǎn)生BMDC。培養(yǎng)7天后，通過相差顯微鏡觀察典型的樹突形態(tài)，圖4A。CD11是一種典型的小鼠DC標(biāo)記物，通常用于體外和體內(nèi)識(shí)別DC。因此，我們根據(jù)CD11C的表達(dá)水平檢查了分離的BMDC的純度。流式細(xì)胞儀顯示CD11C陽性占88.05%，圖4A。這表明后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高純度。

為了探討SP-E2-mi3在小鼠模型上作為自組裝疫苗的潛力，首先評估SP-E2-mi3的細(xì)胞毒性，然后評估其被BM-DCs吞噬的能力。如預(yù)期的那樣，SP-E2和SP-mi3-E2在濃度為100uM時(shí)候，細(xì)胞活力并未受到影響。當(dāng)SP-mi3-E2的濃度達(dá)到200uM時(shí)候，細(xì)胞的活力急劇下降，但是當(dāng)SP-E2的濃度達(dá)到200uM時(shí)候，細(xì)胞的活力仍然達(dá)到90%以上。與SP-E2相比，當(dāng)SP-mi3-E2的濃度達(dá)到200uM時(shí)候，細(xì)胞活力下降的可能原因在于納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的聚集。

隨后，我們使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行抗原的定量檢測。與單體SP-E2相比，SP-mi3-E2的內(nèi)化效率高出了5倍（如圖4C，P<0.001）DC成熟的標(biāo)志是共刺激分子和表面標(biāo)記物的表達(dá)水平上升。暴露于未標(biāo)記的抗原后，相比較于SP-E2抗原，SP-mi3-E2產(chǎn)生的協(xié)同刺激分子CD40的表達(dá)明顯增強(qiáng)，從而促進(jìn)了DC細(xì)胞的成熟。此外，通過共聚焦激光顯微鏡檢查了FITC-SP-E2-mi3和FITC-SP-E2的內(nèi)吞和細(xì)胞定位。與單體SP-E2相比，SP-mi3-E2 NPs得到更強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明提高了抗原結(jié)合和BM-DC的內(nèi)吞作用?？赡艿脑蛟谟谂c一個(gè)單體相比，SP-mi3-E2為60個(gè)單體亞基組成的納米顆粒，使得SP-E2的多重?cái)z取成為可能。

3.5.SP-mi3-E2刺激BM-DC的成熟和細(xì)胞因子的分泌

我們接下來檢測了SP-E2，mi3 NPs及SPE2-mi3刺激BM-DCs后的表面標(biāo)記物和細(xì)胞因子的表達(dá)水平。協(xié)同刺激分子及MHC II類分子的上調(diào)意味著BM-DCs的成熟，如圖6所示，刺激BM-DCs的4小時(shí)后，SP-E2-mi3 NPs及mi3NPs組的 MHCII類分子及表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86水平顯著高于SP-E2組（P<0.001）。DCs釋放的細(xì)胞因子刺激參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對na?ve T cells 分化為 Th1 and Th2起到關(guān)鍵的作用。另一方面，SP-E2-mi3 NPs及mi3NPs組產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子水平（TNF-α和IL-6）的結(jié)果也和上述結(jié)果一致，均顯著高于SP-E2。通過這些結(jié)果，我們總結(jié)出mi3 NPs能夠強(qiáng)有力的刺激BM-DCs成熟，是通過促進(jìn)協(xié)同刺激分子 CD80、CD86和MHC II類分子的表達(dá)完成。

3.6.SP-E2-mi3能夠增強(qiáng)小鼠的體液免疫

作為潛在的疫苗，首次在小鼠上進(jìn)行SP-E2-mi3的潛在效率評估。采用間接ELISA方法檢測CSFV 的E2特異性抗體。如圖7A所述，在首免28天，相較于40ug的SP-E2疫苗組，25ug的SP-E2-mi3 NPs疫苗組能夠產(chǎn)生更高水平的特異性抗體（P<0.01），在14天（P>0.05），兩組沒有差異。值得注意的是，相較于40ug的SP-E2組，同樣是40ug的SP-E2-mi3疫苗組能夠顯著的升高特異性抗體（P<0.01），除此之外，這兩組與25ug的SP-E2-mi3組相比較而言，也能產(chǎn)生更高水平的抗體（P<0.05）。未能在PBS組中檢測到特異性E2抗體。有趣的是，相較于SP-E2組，SP-E2-mi3組能產(chǎn)生更高水平的mi3特異性抗體（圖 7B）。這些數(shù)據(jù)清楚的表明，SP-E2-mi3組產(chǎn)生的E2抗體并不影響SP-E2抗體的產(chǎn)生。

此外，CSFV 1.1基因型（石門株）和臨床基因型2.1（HZ08株）被用來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)中和抗體實(shí)驗(yàn)，評價(jià)針對基因型1.1和基因型2.1毒株的交叉反應(yīng)中和抗體。40ug SP-E2、25ug SP-E2-mi3和40ug SP-E2-mi3組的中和抗體在二免后抗體得到顯著性的提升。相較于40ug SP-E2而言，25ug的SP-E2-mi3疫苗組，針對HZ-08毒株的14dpi和28dpi中和抗體水平有顯著性差異（P<0.05）。除此之外，40ug SP-E2-mi3疫苗組針對HZ08毒株的中和抗體相較于SP-E2有極顯著的差異（P<0.01），如圖7C。

如圖7D圖所示，所有疫苗組的結(jié)果，針對石門毒株的中和抗體水平與HZ08毒株的中和水平相似，相較于40ug SP-E2組，40ug SP-E2-mi3疫苗組針對石門毒株的中和抗體水平有顯著性差異14dpi（P<0.05），28dpi（P<0.01）。相較于40ug SP-E2組，25ug 的疫苗組SP-E2-mi3針對石門毒株產(chǎn)生更高的中和抗體14dpi（P>0.05）和28dpi（P<0.05）?；谶@些結(jié)果，mi3自組裝疫苗能夠提高針對基因型1.1和2.1毒株的交叉中和抗體水平。

3.7.SP-E2-mi3自組裝納米顆粒疫苗能夠提高小鼠的細(xì)胞免疫

具有固有抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用的IFN-r，在疫苗組SP-E2-mi3中的水平得到顯著性提升。如圖8所示，40ug SP-E2-mi3的IFN-r水平最高，其次是25ug的SP-E2-mi3，除此之外，40ug SP-E2的IFN-r水平最低（P<0.0001），IL-4在體液免疫和適應(yīng)性免疫上發(fā)揮作用，因此IFN-r的相似性的結(jié)果也在IL-4上得到體現(xiàn)。針對CSF設(shè)計(jì)的自組裝納米顆粒疫苗，IFN-γ與體內(nèi)對病毒攻擊的保護(hù)效果密切相關(guān)，特別是在早期[33,34]。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了即使在低劑量下，SP-E2-mi3 NPs也比單體SP-E2表現(xiàn)出更好的保護(hù)免疫。

4.?討論：

亞單位疫苗組成簡單，可避免傳統(tǒng)的全病原體抗原的不良反應(yīng)。然而，既往研究表明，同源亞單位疫苗免疫可有效誘導(dǎo)主要的體液免疫反應(yīng)，而不能誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，而這對保護(hù)細(xì)胞內(nèi)病原體至關(guān)重要[35-38]。由于免疫原性較弱，僅含有亞單位疫苗的配方無法很好的適用于人類和其他大型動(dòng)物。遞送系統(tǒng)是研究有效疫苗的關(guān)鍵因素。事實(shí)上，越來越多的研究表明，自組裝蛋白納米顆粒（SAPN）作為遞送系統(tǒng)促進(jìn)了幾種有效疫苗的研發(fā)。這些疫苗具有重復(fù)性抗原，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，疫苗在抗體滴度和動(dòng)物保護(hù)方面得到提高?；谧越M裝蛋白納米的技術(shù)可以成為一種有效的戰(zhàn)略，用于更快速生產(chǎn)和更廣泛的有效疫苗，可以預(yù)防不斷出現(xiàn)的病原體(如流感病毒、人類冠狀病毒)[42-44]。大量研究表明，NPs可以作為有吸引力的支架，用于靶向顯示免疫原性表位或蛋白質(zhì)，以生成針對多種致病性感染的嵌合納米疫苗。然而外來插入的片段大小是有限制的，更大的插入可能導(dǎo)致組裝蛋白的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致自組裝蛋白的無法形成。這些限制導(dǎo)致了基于NPS的疫苗的廣泛應(yīng)用。

實(shí)際上，很多自組裝納米顆粒疫苗已經(jīng)被提出，包括病毒樣顆粒，鐵蛋白，膠囊等，通常，外源蛋白或者表位被融合進(jìn)入納米顆粒上，從而使得外源蛋白或者表位被展示及鑲嵌在納米顆粒上。為了保持自組裝能力和NP的穩(wěn)定性，這些納米顆粒的所能容納外源蛋白的能力僅為100 aa。因此，我們提出了一種自組裝肽的疫苗設(shè)計(jì)策略。我們首先研究了插入片段大小的屬性（抗原/表位大?。?、NP的形成能力和NP的穩(wěn)定性。不同的靶標(biāo)蛋白范圍從113aa-354aa，被串聯(lián)到mi3上作為融合蛋白。所有的融合蛋白在體外均能自組裝成均勻的納米顆粒。除此之外，通過掃描電鏡和動(dòng)態(tài)光散射，我們可以確定外源基因融合到N端可以展示在骨架蛋白的外圍。這與之前報(bào)道的mi3單體N端展示在外圍是具有一致性的。

SP-E2作為候選疫苗中分子量最大的（高達(dá)354 aa）,被選為進(jìn)一步研究的備選疫苗。

正如預(yù)期的那樣，SP-E2-mi3自組裝蛋白在25~65℃中表現(xiàn)出完美的穩(wěn)定性。即使這些NPs在室溫下保存4周后，仍能保存85%以上的NPs，并表現(xiàn)出較高的粒徑均勻性和長期穩(wěn)定性，由于該方案沒有進(jìn)行充分的優(yōu)化，如果添加常見的穩(wěn)定劑，例如山梨醇和海藻糖會(huì)使得聚合更小。該保護(hù)劑是否適用于SP-E2-mi3 NPs仍有待驗(yàn)證，目的是為了開發(fā)在生產(chǎn)、長期儲(chǔ)存、運(yùn)輸和管理過程中具有可靠安全性和有效性的穩(wěn)定疫苗配方。糖蛋白E2是CSFV主要的保護(hù)性抗原，位于病毒囊膜蛋白。E2在CSFV的外圍展示和CSFV的病毒結(jié)構(gòu)存在很大的相似性。這與反向疫苗學(xué)的一個(gè)重要原理是一致的，即成功的疫苗開發(fā)是基于整個(gè)病原體[49]中保守的表面暴露蛋白。這些結(jié)果表明，靶mi3 NPs可能是一種理想的納米疫苗開發(fā)平臺(tái)。

眾所周知納米顆粒粒徑大小越接近病原體（10-200 nm）更加適合于APC細(xì)胞捕獲同時(shí)促進(jìn)APC的成熟，從而促進(jìn)了適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)。與可溶性抗原相比，納米顆粒遞送的抗原能夠增強(qiáng)APC的吸收和內(nèi)化。同樣的，TEM和DLS顯示SP-E2-mi3納米顆粒直徑約為30nm，其中60個(gè)SP-E2-mi3單體形成統(tǒng)一的納米顆粒，進(jìn)一步的結(jié)果表明，SP-E2-mi3在100mM濃度時(shí)并沒有明顯的細(xì)胞毒性，同時(shí)也促進(jìn)了APC抗原的捕獲。更重要的是，與SP-E2相比，通過上調(diào)標(biāo)記分子MHC II和共刺激分子（CD40、CD80和CD86），SP-E2-mi3更能促進(jìn)DC的成熟。結(jié)果中，促炎細(xì)胞因子（TNF-a和IL-6）的表達(dá)得到極大的促進(jìn)，而這在病毒清除和宿主免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要的作用。這些改進(jìn)被認(rèn)為能夠促進(jìn)抗原的交叉呈遞，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)病原體的清除。

考慮到SP-E2-mi3 NPs具有良好的體外的疫苗性能，我們在小鼠模型上進(jìn)一步評估了基于NP的CSFV疫苗的潛力。SP-E2-mi3免疫后的各項(xiàng)指標(biāo)與之前的以NP為基礎(chǔ)的疫苗免疫結(jié)果一致，說明了SP-E2-mi3促進(jìn)了特異性免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答（CSFV特異性抗體和中和抗體）和細(xì)胞免疫應(yīng)答（IFN-r和IL-4），與SP-E2相比，即使低劑量的SP-E2-mi3 NPs也能得到提升。有趣的是，針對mi3 NPs的抗體并沒有干擾SP-E2的抗體產(chǎn)生，從而減少了骨架蛋白的潛在副作用。此外，mi3來源于人工合成自組裝蛋白質(zhì)分子，并不會(huì)引起任何副作用或安全問題。這一發(fā)現(xiàn)為基于np的策略比合理的亞單位疫苗具有更大的優(yōu)勢提供了支持證據(jù)，與單體抗原相比，低劑量的NPs可以誘導(dǎo)類似或更高水平的免疫應(yīng)答[54,55]。

之前的文獻(xiàn)表明，NP以特定的方向展示抗原，高密度的抗原列陣產(chǎn)生與BCRs的多次結(jié)合，這對高水平的中和抗體的產(chǎn)生起到至關(guān)重要的作用。自組裝蛋白NPs靶向展示抗原及模仿了一種自然構(gòu)象抗原，從而提高了疫苗效力，擴(kuò)大對于多種疾病的功效。亞單位疫苗大多數(shù)進(jìn)行兩次免疫首免-加強(qiáng)策略，其中，首免和加強(qiáng)被給予同樣的劑量和相同的免疫途徑。大多數(shù)亞單位疫苗都需要進(jìn)行多次免疫和大量抗原，這增加了疫苗接種的成本，特別是針對大型動(dòng)物。這些發(fā)現(xiàn)表明基于NP遞送系統(tǒng)能夠克服傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)，如細(xì)胞免疫差和多劑量。

盡管許多研究者認(rèn)識(shí)到納米顆粒呈遞外源的抗病毒或者抗癌的疫苗的潛力，但是這個(gè)疫苗的實(shí)際有效性是我們不能忽視的重要因素。通過使用基因融合技術(shù)，SAPNs展示出超前的優(yōu)勢在與納米顆粒連接效率及靶標(biāo)抗原的包封方面（接近100%），而這些與疫苗的效力密切相關(guān)。然而靶抗原與納米顆粒的N端或C端融合導(dǎo)致靶抗原在納米顆粒的外圍或者內(nèi)部定位效果不同。基于SAPN的疫苗依賴于抗原的定向展示。mi3在這個(gè)研究中，目標(biāo)抗原的融合在N端則展示在納米顆粒的外表面，而C端融合則占據(jù)著納米顆粒的內(nèi)表面。之前的研究表明自組裝AP205蛋白的末端是表面暴露的，盡管N端或者C端的融合對于抗原的展示外表面是影響不大的。但是鐵蛋白的納米顆粒，抗原融合在N端策略是展示在外表面的，PCV2 Cap蛋白（豬圓環(huán)2型帽子蛋白）或者HBC（乙肝核心抗原）SAPNs依賴于插入骨架蛋白主干的抗原。抗原與SAPNs的融合使得納米顆粒疫苗的制作簡化，并減少了工業(yè)生產(chǎn)的時(shí)間。使用自組裝納米顆粒疫苗的考慮的另一個(gè)因素是NPs的免疫原性。納米顆粒蛋白不能或者誘導(dǎo)非常低的免疫反應(yīng)。免疫原性強(qiáng)的NPs可能產(chǎn)生潛在的副作用或者抗NPs抗原的表位抑制。在我們的研究中，首次和增強(qiáng)后，SP-E2-mi3 NPs免疫小鼠后未觀察到副作用和抗體感染。

值得注意是，基于SAPNs的疫苗受限于外源抗原的大小，由于空間位阻導(dǎo)致蛋白的折疊不當(dāng)，超大的抗原融合往往會(huì)損害NPs的形成穩(wěn)定性。已經(jīng)應(yīng)用了很多方法來繞開SAPNs的缺點(diǎn)。(Fe3O4和FeHA)納米顆?；蚪鸺{米顆粒(AuNPs)具有調(diào)節(jié)抗原遞呈途徑的能力，提供了一種后組裝方式來裝飾納米顆粒外源抗原與賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的化學(xué)偶聯(lián)。聚乳酸共乙醇酸(PLGA)顆粒、多糖基NPs和聚酸酐基NPs也被用于包封高度保守的抗原并對疫苗接種進(jìn)行評估。然而，由于嚴(yán)格的結(jié)合/包封條件和效率，這些技術(shù)可能導(dǎo)致疫苗的異質(zhì)性。為了進(jìn)一步拓寬SANPs在疫苗傳遞中的應(yīng)用，新開發(fā)的SpyCatcher/SpyTag策略是一種新穎的、特異性的、自發(fā)的和不可逆的蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法，通過SpyCatcher(蛋白質(zhì))與蛋白之間自發(fā)形成異肽鍵進(jìn)行蛋白偶聯(lián)SpyTag(肽)。該反應(yīng)條件溫和、定向，不需要化學(xué)偶聯(lián)劑，可保持大抗原的自然結(jié)構(gòu)[62]。因此，更全面地了解這些策略對于隨時(shí)準(zhǔn)備和合理使用SANPs以更有效地提供疫苗至關(guān)重要。

總之，我們開發(fā)一種基于mi3自組裝的新型抗原遞送系統(tǒng)。靶抗原與自組裝肽骨架蛋白是一種基因融合形式，攜帶大尺徑的外源抗原（高達(dá)354aa）能夠自發(fā)自組裝成穩(wěn)定的NPs。由于mi3的N端是暴露在外表面的，所以N端插入的病毒抗原在NPs上實(shí)現(xiàn)了表面展示。SPE2-mi3 NPs表現(xiàn)出完美的熱穩(wěn)定性(25至65℃)和室溫下的長期儲(chǔ)存。此外，我們已經(jīng)證明了利用該技術(shù)制備的CSFV E2疫苗增強(qiáng)了BM-DCs對抗原的吸收，上調(diào)了成熟和免疫刺激細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)了抗原的加工和交叉呈遞。重要的是，與單體E2相比，納米疫苗同時(shí)提高了CSFV特異性中和抗體和細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-4)，這與對抗CSFV的體內(nèi)保護(hù)效果密切相關(guān)。我們首次研究了納米疫苗提高療效的機(jī)制，并在小鼠模型上完成了疫苗試驗(yàn)。這種高度穩(wěn)定和基于結(jié)構(gòu)的自組裝NP可以加速自組裝納米顆粒在納米生物技術(shù)和疫苗開發(fā)中的廣泛應(yīng)用。

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