一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解利用動物骨髓進(jìn)行細(xì)胞染色體制片的一般方法，掌握細(xì)胞收集、低滲、滴片等技術(shù)手段。觀察和了解小鼠染色體的數(shù)目及形態(tài)特征。利用顯微照相技術(shù)對所得切片進(jìn)行照相。

二、實(shí)驗(yàn)原理

染色體上的基因決定了一個物種生長發(fā)育的全部信息。因此通過染色體分析，可以了解某一物種最基本的遺傳指標(biāo)。進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備一般取自細(xì)胞分裂旺盛的組織，如骨髓、淋巴細(xì)胞以及通過人工培養(yǎng)的懸浮液。如將秋水仙素注射到動物的腹腔內(nèi)，經(jīng)腸系膜吸收并可轉(zhuǎn)運(yùn)到骨髓，結(jié)果使正在分裂的細(xì)胞不能形成紡錘體，使得染色體停在中期狀態(tài)，經(jīng)過處理和制片后就可以清楚地觀察到染色體。這種制片方法是屬于侵害性的，因此這種方法適用于動物來源豐富、動物個體較小的材料。對于大型動物可以采取骨髓穿刺術(shù)獲得紅骨髓，在臨床上用于一些血液疾病的研究分析。對于一些珍稀的鳥類可采用羽髓來制片，方法基本一樣。人類的染色體分析可采用外周血培養(yǎng)的方法來獲得大量的細(xì)胞材料。

三、 實(shí)驗(yàn)用具及材料

實(shí)驗(yàn)材料：體重20克左右的小鼠一只

實(shí)驗(yàn)試劑：0.075mKCl低滲液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品紅溶液、二甲苯?

實(shí)驗(yàn)材料：恒溫水浴槽、紗布、燒杯、離心管2支、刀片、鑷子、解剖盤、解剖剪、鑷子、注射器、離心機(jī)、鏡頭紙

光學(xué)顯微鏡、帶數(shù)碼相機(jī)的光學(xué)顯微鏡

四、 實(shí)驗(yàn)步驟

腹腔注射秋水仙素溶液：在做實(shí)驗(yàn)前2~3小時，對實(shí)驗(yàn)用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量對其進(jìn)行0.4％的秋水仙素注射。

取材：實(shí)驗(yàn)時，用斷頸法迅速將小鼠處死，通過解剖取出股骨，用注射器吸取在37℃下保溫的低滲液2毫升，將針頭插入骨髓腔中沖洗骨髓，使沖洗液從股骨的另一端流出。收集沖洗液到5ml刻度的離心管中。

低滲：用吸管將沖洗液吹打幾次，然后把離心管放在37℃恒溫水浴槽內(nèi)低滲20分鐘。

固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒溫水浴槽內(nèi)固定10分鐘。

離心：然后將1000rpm離心10分鐘，棄去上清。

再固定：加入固定液繼續(xù)固定10分鐘（先吹打，再放入恒溫水浴槽）。

離心：再1000rpm的速度離心10分鐘。棄去上清，

制備細(xì)胞懸液：離心結(jié)束棄上清，最后留大約與沉淀等量的上清液，

滴冰片：從冰箱里取出預(yù)冷的載玻片4塊并排，手持吸管在載玻片上方向下滴片。

干燥：讓其自然晾干。

染色：用改良苯酚品紅溶液染色10分鐘左右。

去浮色：清水沖洗，風(fēng)干。

鏡檢：先用低倍鏡找到一好的分裂相區(qū)域，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。

觀察和照相：用油鏡觀察，并選取良好的視野照相。

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)討論

1）影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要步驟：

（1）秋水仙素的注射

? ? ?雖然這一步不是我們完成的，但是它對于本次實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，如果沒有秋水仙素使正在分裂的細(xì)胞不能形成紡錘體，使得染色體停在中期狀態(tài)，因?yàn)榧?xì)胞分裂中期在整個分裂期中占的比例不大，我們就很難得到那么多分裂中期的細(xì)胞，也就難以觀察。

（2）取骨

? ? ? 取骨可參照人的大腿骨位置，而不是主觀地判斷其大小，取骨后一定要把肌肉除凈，否則最后的制片效果會受到影響。

（3）低滲

? ? ? 分析我們裝片分散不夠好的原因，我認(rèn)為主要問題就出在低滲上。低滲液可以使細(xì)胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細(xì)胞很快破碎，染色體進(jìn)一步分散開。如果細(xì)胞低滲處理不夠，在細(xì)胞從高處掉下也無法摔碎，染色體將難以觀察。

（4）滴片

? ? ? 經(jīng)過實(shí)踐，我們認(rèn)為吳老師說得很對，越高越好，在我們可達(dá)到高度范圍內(nèi)，基本不用擔(dān)心染色體摔碎的問題。比較了我們的片子和個子高的同學(xué)的片子，我們更加確信了這一結(jié)論。（我們都是站著往地上滴片的。）

六、實(shí)驗(yàn)小結(jié)

這次實(shí)驗(yàn)要注意的地方：

處死小鼠的時候要果斷。這次實(shí)驗(yàn)采用斷頸法殺死小鼠，按住頭部后要用力拉。出于人道主義和對實(shí)驗(yàn)對象的尊重，我們都應(yīng)該讓小鼠在最少的折磨中死去。

取骨后要清理干凈。

注射低滲液的時候要注意看，如果液體從針頭入口出來，說明另一頭沒有剪開，應(yīng)該再剪一次。

低滲液處理時間可以長一點(diǎn)。

第二次加固定液是1ml而不是書上寫的5ml，實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加1ml和加5ml區(qū)別不大，但從節(jié)約的角度，選取1ml。

滴片要高。

找到好的視野后要記住它的位置，方便顯微攝像。

七、思考題

1. 顯微照相見圖一。

2. 統(tǒng)計(jì)小鼠2N染色體數(shù)目，仔細(xì)觀察其形態(tài)特征。

小鼠體內(nèi)2n染色體數(shù)目為40條，形態(tài)上多為中部著絲粒染色體。

3. 低滲液起什么作用，在使用過程中應(yīng)注意什么問題？

答：低滲液的作用是使細(xì)胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細(xì)胞及其核很快破碎，染色體進(jìn)一步分散開。在滴片的時候就能夠獲得一團(tuán)僅屬于一個細(xì)胞的分散的中期染色體的片子，易于在顯微鏡下觀察和對染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用時應(yīng)該十分注意適當(dāng)?shù)牡蜐B時間和溫度，以及低滲液的濃度。