3.2.2 目的基因的篩選與獲取

一、基因工程基本操作概述?

基因工程的基本操作程序：

1.目的基因的篩選與獲取

2.基因表達載體的構(gòu)建

3.將目的基因?qū)胧荏w細胞

4.目的基因的檢測與鑒定

1.目的基因的定義及結(jié)構(gòu)

(1) 目的基因的定義及種類

在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。 根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因， 如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。例如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。

2.篩選合適的目的基因

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)，序列對比工具(如BLAST)等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，所以從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

3.目的基因的獲取方法

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，獲取目的基因。

二、目的基因的篩選與獲取?

【方法一：直接從供體生物細胞中分離目的基因】

最常用的方法是：“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。

適用對象：從簡單的基因組中分離目的基因，如原核基因、質(zhì)粒或病毒。

具體操作：用限制酶將供體細胞的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在受體細胞中大量復(fù)制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞（菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物檢測法等）。

【方法二：從基因文庫中分離目的基因】

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體

中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。分為基因組文庫和部分基因文庫（如cDNA文庫）

【方法三：化學(xué)合成法】

1.適用對象：長度短且堿基序列已知的DNA的合成。例如，合成PCR的引物、基因探針、人工接頭等。

2.根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：

【方法四；利用PCR獲取和擴增目的基因】

1.前提：DNA片段序列完全已知或至少其兩端20bp左右序列已知以便設(shè)計引物

2.過程：90℃以上（變性）→50℃左右（復(fù)性）→72℃左右（延伸)

3.條件：模板DNA，dNTP，引物，TaqDNA聚合酶，緩沖液，Mg"。

4.擴增DNA檢測方法：瓊脂糖凝膠電泳

【方法五：RT（反轉(zhuǎn)錄）一PCR法】

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