1、問(wèn)：做間接法免疫熒光染色，要怎么設(shè)置對(duì)照？

參考見(jiàn)解：最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照，看是否非特異性染色。
（1）空白對(duì)照：如果你作的是石蠟切片的免疫組化，這一個(gè)對(duì)照必須有，目的是看自發(fā)熒光。脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。
（2）陰性對(duì)照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。
（3）抗原對(duì)照：標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動(dòng)物的血清中無(wú)特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。
2、問(wèn)：免疫熒光：用免疫熒光方法做同樣的內(nèi)容，組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞，兩者操作過(guò)程中有哪些不同？
參考見(jiàn)解：只是固定方法不同，細(xì)胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
（1）你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光。
（2）封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明更亮。
（3）關(guān)于免疫酶染色，如果是用過(guò)氧化物酶做標(biāo)記，就必須用3%H2O2以去除內(nèi)緣性過(guò)氧化物酶。
（4）如果要做蘇木素復(fù)染，可用鹽酸溶液去除蘇木素。

3、問(wèn)：近期要做免疫熒光雙標(biāo)，不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟以及注意事項(xiàng)？
參考見(jiàn)解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光的雙染。有些體會(huì)：
（1）選取primary antibodies時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
（2）我的做法是兩種primary antibodies同時(shí)孵育，然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索，我感覺(jué)primary antibodies 4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較干凈。
（3）我的陽(yáng)性對(duì)照采用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。
（4）Block用的血清使secondary antibody來(lái)源動(dòng)物的血清，我的是10%的正常donkey血清。
（5）其余同一般操作。
4、問(wèn)：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好，有陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照組也沒(méi)有熒光，但是拿到熒光纖維鏡下看，我的陰性對(duì)照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢？
參考見(jiàn)解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問(wèn)題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒(méi)有問(wèn)題，那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主。抗體分裝、及熒光顯微鏡觀察結(jié)果是否一定要在暗室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1. 首先我們要熟悉激光共聚焦的使用方法，開機(jī)和關(guān)機(jī)順序要注意，尤其是激光器的使用，務(wù)必要預(yù)熱 10 到 15 分鐘方可打開激光。
2. 在 smart set up 中選擇 best signal，對(duì)應(yīng)相應(yīng)的激光波長(zhǎng)選擇相應(yīng)的顏色（488-FITC，568-RHOD，647-White，后期也可在軟件中進(jìn)行修改）。
3. 拍攝過(guò)程中要注意選擇的像素和拍攝速度，一般選擇 1024*1024，speed 為 5-7。