喵喵 | 3-2 基因工程—PCR技術(shù)

1??PCR定義及原理

1. PCR的原理（polymerase chain reaction）

PCR技術(shù)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法，也稱聚合酶鏈式反應(yīng)，原理為DNA的半保留復制。在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)的DNA復制類似。

1. 多起點
2. 雙向復制
3. 邊解旋邊復制
4. 半保留復制

2??PCR的條件及過程

1. 條件

（1）模板：DNA母鏈

（2）原料：4種脫氧核苷酸

（3）引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

①長度通常為20-30個脫氧核苷酸

②引物自身不應(yīng)存在互補序列而引起自身折疊，引物之間不應(yīng)存在互補序列

③PCR反應(yīng)中有兩種引物

（4）耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶)︰催化合成DNA子鏈。

（5）緩沖液、Mg2?：提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子；Taq酶的活性需要Mg2?。

2. 過程

PCR的過程包含變性、復性和延伸三個階段。

變性：90℃以上

復性：50℃左右

延伸：72℃左右

【提問】

是否需要知道目的基因的全部序列？

• 否，只知道這兩段即可

想獲取目的基因至少進行幾個循環(huán)？

• 3個循環(huán)

3. PCR結(jié)果

使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。

理論上1個DNA分子擴增n個循環(huán)的DNA數(shù)為2?，只含引物1和只含引物2的DNA分子一共所占的比例是2/2?.

例題1

實驗室內(nèi)模擬生物體DNA復制時，不需要的條件是

①酶

②游離的脫氧核苷酸

③游離的核糖核苷酸【不合成RNA】

④氨基酸【不合成蛋白質(zhì)】

⑤DNA分子

⑥能量

⑦適宜的溫度

⑧適宜的酸堿度

A. ①②③④⑤⑥

B. ②③⑤⑥

C. ③④⑦⑧

D. ③④?

例題2

PCR技術(shù)的操作步驟依次是

A. 高溫變性、中溫延伸、低溫復性

B. 高溫變性、低溫復性、中溫延伸?

C. 中溫延伸、高溫變性、低溫復性

D. 中溫延伸、低溫復性、高溫變性

3??PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

1. 方法及原理

（1）方法：瓊脂糖凝膠電泳

（2）原理：

①DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下會向正極泳動。DNA分子質(zhì)量越小，遷移速率越快。

②凝膠中的DNA分子可通過核酸染料染色被檢測出來。如核酸染料溴化乙錠（EB）

2. 材料及過程

（1）材料用具：電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽、制膠槽、梳子等）、微量移液器、紫外檢測儀、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。

（2）過程：配膠→點樣→電泳→檢測

3. 電泳圖分析

（1）Marker (M)︰標準樣，一個已知分子質(zhì)量的DNA樣品，作為對照，

用來確定待測樣品中DNA的相對分子質(zhì)量。

（2）DNA熒光條帶：

①條帶的有無：代表是否成功擴增出待測樣品中的DNA。

• 若無條帶，常見原因有：無DNA模板，引物設(shè)計不合適。

②條帶的亮度：代表擴增的DNA數(shù)量，越亮代表DNA數(shù)量越多

③條帶的位置：常代表DNA的大小。一般距離點樣孔越遠，說明跑的越快，DNA的分子質(zhì)量越小。

4. PCR的應(yīng)用

廣泛應(yīng)用于基因工程目的基因的獲取、遺傳病的診斷、刑偵破案和DNA序列測定等。

例題3

瓊脂糖凝膠電泳是檢測核酸長度常用的方法，在某次實驗中，得到如下的結(jié)果，請根據(jù)圖像選擇說法不合理的是

A. B端是電泳的起始端【A端，從大到小】

B. 核酸的電泳速度與其片段大小成負相關(guān)關(guān)系

C. 1 號樣品為Marker組，用于標定其他組核酸片段的大小

D. 2，3，4號樣品中均只含有一種DNA分子【4有兩種】