在制藥過程中，細菌內(nèi)毒素的檢測依賴于鱟血資源。隨著注射劑、疫苗類、化學藥品類等制劑品的需求不斷增長，鱟血資源的使用率越來越高；同時，鱟試劑中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。所以，建立一套不依賴鱟生物進行細菌內(nèi)毒素檢測的快捷、高效的補充替代方法尤為重要。

作為新型的重組鱟試劑檢測方法：重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)則備受關(guān)注。

一、重組鱟試劑(rCR)和重組C因子(rFC)的概念

01 重組鱟試劑(rCR)

重組鱟試劑(rCR)是一種基因工程技術(shù)合成的細菌內(nèi)毒素定量檢測試劑，該試劑不依賴鱟血資源，滿足可持續(xù)發(fā)展的目標。

它完全模擬了天然鱟試劑(LAL)的酶聯(lián)反應(yīng)，包含C因子、B因子、凝固酶原，是唯一一種擁有與天然鱟試劑(LAL)相同酶聯(lián)反應(yīng),同時又消除了與1,3-β-D-葡聚糖交叉反應(yīng)造成假陽性結(jié)果的內(nèi)毒素檢測試劑。

02 重組C因子(rFC)

重組C因子(rFC)是通過體外重組鱟凝血級聯(lián)反應(yīng)的第一個組分：C因子，激活的C因子直接剪切一個熒光底物，產(chǎn)生的信號被熒光酶標儀識別。相較于天然鱟試劑(LAL)，重組C因子法只有一種反應(yīng)機制。

二、天然鱟試劑(LAL)、重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)對比情況

作為新型的重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)，與天然鱟試劑(LAL)進行細菌內(nèi)毒素檢測時又會有什么不同呢？

01 重組鱟試劑(rCR)與天然鱟試劑(LAL)在檢測內(nèi)毒素上比較

由圖1所示，通過研究在顯色底物存在下，使用三種重組酶原的多種組合，確定三種重組酶原是否能重建反應(yīng)步驟。

結(jié)果證實，當三種重組酶原同時存在時，內(nèi)毒素才能激活蛋白酶活性，得出了重組鱟試劑(rCR)與天然鱟試劑(LAL)在檢測內(nèi)毒素上具有等效性。另外，研究證實了，三種重組酶原的蛋白酶活性大大增強，信號放大。

02 天然鱟試劑(LAL)、重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)對內(nèi)毒素敏感度比較

從反應(yīng)機制上看，重組C因子(rFC)缺少了級聯(lián)放大的兩個環(huán)節(jié)（加速反應(yīng)），只能通過熒光檢測人為放大（減少了來源于自然反應(yīng)的特異性）。

如圖2所示，凝血酶的活化是天然鱟試劑(LAL)信號放大的主要驅(qū)動力；B因子的活化是針對內(nèi)毒素的特異性活化，由此可以得出，重組鱟試劑(rCR)敏感度比重組C因子(rFC)更高。

03 重組鱟試劑(rCR)與天然鱟試劑(LAL)檢測時間比較

如圖3所示，通過對一系列濃度RSE（細菌內(nèi)毒素參考標準品）應(yīng)用重組鱟試劑(rCR)和典型動態(tài)顯色試劑檢測得到的起始時間值，得出重組鱟試劑(rCR)較典型的動態(tài)顯色試劑檢測縮短了大約一半的時間。

04 重組鱟試劑(rCR)與天然鱟試劑(LAL)批間一致性比較

天然來源的天然鱟試劑(LAL)試劑具有固定的批次間變異性，而重組鱟試劑(rCR)表現(xiàn)出批次間的一致性。圖4所示，六個單獨批次的重組鱟試劑(rCR)的曲線標準趨于一致，證明重組鱟試劑(rCR)具有重復(fù)性和可預(yù)測性的性能。

05 重組鱟試劑(rCR)與天然鱟試劑(LAL)對內(nèi)毒素特異性比較

圖5的X-Y軸分別表示的是加標/不加標1,3-β-D葡聚糖的各批次重組鱟試劑(rCR)和系列標準濃度的反應(yīng)。結(jié)果顯示了添加1,3-β-D葡聚糖對應(yīng)用重組鱟試劑(rCR)對內(nèi)毒素的檢測不存在干擾，各批次間相關(guān)性良好。

06 重組鱟試劑(rCR)驗證性能

如圖6、圖7所示，應(yīng)用重組鱟試劑(rCR)在0.005 -50--EU/mL內(nèi)毒素范圍內(nèi)，在兩批次、四個分析人員、三天內(nèi)條件下，執(zhí)行了24個性能驗證實驗。依據(jù)ICH Q2指南標準，結(jié)果顯示各驗證參數(shù)滿足標準要求。

07 重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)、天然鱟試劑(LAL)針對檢測樣品的比較

圖8、圖9、圖10所示，適合性/一致性研究測試了多個成品、水、緩沖液等樣品，得出重組鱟試劑(rCR)較然鱟試劑(LAL)具有相等或較低的不干擾稀釋倍數(shù)(NID)。另外，Muroi 等人報告了使用重組鱟試劑(rCR)前身 PyroSmart 試劑檢測藥典118種腸外注射藥物得出了相似的結(jié)果。

基于以上數(shù)據(jù)得出結(jié)論，重組鱟試劑方法(rCR)適合于廣泛的產(chǎn)品檢測?？杀刃匝芯繙y試了多種來源的細菌內(nèi)毒素和水樣，證實應(yīng)用重組鱟試劑(rCR)檢測具有較好的相對回收率。

08 重組鱟試劑(rCR)、天然鱟試劑(LAL)、重組C因子(rFC)方法對比

如圖11 所示，重組鱟試劑(rCR)優(yōu)于重組C因子(rFC)。重組鱟試劑(rCR)檢測過程不需要更換方法和設(shè)備，就能繼續(xù)同樣的工作流程。

三、總結(jié)

從天然鱟試劑(LAL)、重組鱟試劑(rCR)、重組C因子(rFC)對比情況來看，重組鱟試劑(rCR)較重組C因子(rFC)、天然鱟試劑(LAL)在細菌內(nèi)毒素檢測上具有較強的優(yōu)勢：

相比重組C因子(rFC)內(nèi)毒素檢測方法，重組鱟試劑(rCR)可以產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，使得內(nèi)毒素檢測更加高效和靈敏。

文章參考來源：PYROSMART NEXTGEN RECOMBINANT LAL REAGENT