自CRISPR/Cas9技術于2012年開發(fā)出來，這項基因編輯工具徹底改變了生物學研究，使研究疾病更加容易，研發(fā)藥物的進程更快。由于其簡單的機制，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成為當今世界基因組編輯的同義詞。CRISPR系統(tǒng)是一種精確的基因組編輯技術，可通過用所需供體序列替換掉靶基因序列，由此進行基因敲除或敲入基因組操作。在細胞系中敲入報告基因是CRISPR/Cas9最常見的應用之一，本文詳細介紹了報告細胞系的原理、構建策略以及應用前景，希望能給廣大科研工作者提供一個比較前沿的研究思路。

1.什么是報告細胞系和報告基因？

報告細胞系是指那些用報告基因標記的穩(wěn)定表達細胞系，可用于可視化、跟蹤和分離目的基因。報告細胞系可通過由目的基因的啟動子驅動的、帶有易檢測的標簽（如GFP）的外源表達來產生。然而，由于外源表達水平可能對實驗結果造成不可預知的影響，因此研究人員更傾向于具有內源表達報告基因。在這種情況下，通過將標簽（例如GFP）敲入到目的基因的啟動子下游來產生的報告細胞系是最佳的選擇。

報告分子可以是熒光蛋白和發(fā)光蛋白。如綠色熒光蛋白（GFP），當它暴露于藍色至紫外線范圍內的光時就會顯示亮綠色熒光；而熒光素酶（luciferase）則催化與熒光素的反應并產生光。在其他情況下，報告分子也可以是與目的基因融合的標簽，例如谷胱甘肽S-轉移酶（GST），組氨酸（HIS）和flag標簽。針對目的基因的產物，這些標簽可用于基于抗體的檢測和基于親和力的蛋白分離。

2.產生報告細胞系的敲入方案/策略

為了引入外源DNA，需要將報告基因整合進基因組。研究人員可以在靶基因啟動子的下游直接引入報告基因編碼序列（例如eGFP）（見圖1B）。另一種策略是用報告基因編碼序列替換掉靶基因的特定基因座并產生截短蛋白（見圖1C）。也可以用IRES連接報告基因和目的基因，在天然轉錄調控機制的控制下作為單個轉錄物與內源基因共表達（見圖1D）。此外，報告基因編碼序列也可以引入到終止密碼子之前的N/C末端并由內源啟動子控制（圖1E）。這些策略常用于產生敲入細胞模型，如圖1所示。

圖1: 報告基因敲入的常見策略

源井生物可提供以上各種常見策略的KI細胞構建服務。利用自主開發(fā)的CRISPR-UTM系統(tǒng)修飾了100多種細胞系。CRISPR-UTM系統(tǒng)優(yōu)化了gRNA設計和靶向載體骨架。剪接和重組的效率遠高于傳統(tǒng)的CRISPR。報告基因的KI效率可達到傳統(tǒng)方法的10倍。

3.報告細胞系的應用前景

研究基因啟動子的轉錄活性

具有內源標記基因的細胞系可以讓研究人員能夠在活細胞中實時跟蹤蛋白質的產生和定位。這些細胞系也適用于蛋白質印跡，蛋白質分離純化，親和層析，免疫細胞化學和流式細胞術等。當沒有好用的抗體時，利用這些細胞系也是一個好的解決辦法。當內源基因被敲除的同時，報告基因通過同源重組被敲入，以達到目的基因被報告基因（例如EGFP）所取代的目的。重組后，目的基因的啟動子將調節(jié)被插入的報告基因的表達。通過熒光素酶敲入來研究人SREBP1基因的轉錄調控就是其中一個應用例子。在這項研究中，研究人員將一份外源熒光素酶基因整合到宿主基因組的一個等位基因中，另一個等位基因被刪掉目標序列中的14 bp。熒光素酶活性與HEK293-SREBP1-T2A-luciferase敲入細胞系中內源性SREBP1基因的啟動子活性有著直接相關的關系。

蛋白質在細胞中的表達，定位和轉運

基因表達的可視化可以通過將標簽序列添加到目的基因的末端（或起始端）并產生融合蛋白來實現。然后我們就可以利用熒光來持續(xù)監(jiān)測內源蛋白和重組蛋白的表達水平。利用這個熒光報告分子就可以定量任何你想要的進行定量的蛋白質。GFP-LC3 293FT報告基因敲入細胞就是一個應用例子（圖3），其中GFP被添加到內源性LC3的N-末端。因此，構建敲入報告基因的GFP-LC3就可以進行GFP-LC3融合蛋白表達，且表達是由內源啟動子驅動的，并不會改變靶基因的表達。內源性GFP-LC3報告系統(tǒng)顯示細胞自噬活性的準確的鑒定和定量。內源性GFP-LC3報告系統(tǒng)通過應激誘導的自噬以及藥物（雷帕霉素）誘導/抑制自噬研究來驗證。如作者所示，游離GFP蛋白增加，其信號仍然分散，但在誘導自噬時更強，而GFP-LC3在自噬抑制時會變成點狀。

圖3: 293FT細胞中MAP1LC3B基因座處敲入GFP-LC3。

候選藥物的目標識別和評估

KI細胞系可用于藥物靶標鑒定和候選評估。一旦選擇特定基因作為靶標，設計KI方案，將目的基因與敏感度高的報告基因融合（如螢火蟲熒光素酶基因）的細胞模型，產生易于測量的光信號，反映目的基因轉錄的變化。當用適當化合物處理KI細胞系時，就可以產生反映基因表達特定變化的光信號。 因此，利用報告細胞系的測定可以做到快速篩選大量樣品并排除那些具有細胞毒性或不能與細胞相互作用的化合物。其中，作為利用報告細胞系來評估藥物靶標的一個例子，HELA細胞系被核蛋白（Histone 1-mtagBFP2），細胞骨架標記物（βtubulin-mClover3），和已知的自噬受體蛋白（SQSTM1-mRuby3）標記，以篩選能誘導細胞質自噬囊泡積累的激酶抑制劑（具有已知靶標），從而評估自噬囊泡的積累。研究人員用兩種激酶抑制劑PLK1抑制劑BI-6727和PIM激酶抑制劑CX-6258來處理細胞，這兩種激酶抑制劑會增加自噬囊泡的數量，例如一種已知的自噬抑制劑——羥氯喹（圖4）。

圖4: 三重標記的HELA細胞系中誘導自噬囊泡積累的激酶抑制劑的驗證。

總結以上發(fā)現，通過基因敲入產生的報告細胞模型對于功能研究（例如監(jiān)測基因表達和亞細胞定位）是常用的，且有利于進行高通量藥物篩選。

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