凌恩生物重磅推出HiFi-meta技術服務，三代宏基因組測序組裝方案全新升級！獲得完成圖水平的MAGs，助力更全面的功能基因挖掘，深耕可移動基因單元-宿主關系，歡迎廣大微生態(tài)領域研究用戶垂詢。

期刊：Gigascience ???????????????影響因子：7.658發(fā)表時間：2022年11月

養(yǎng)雞業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要產業(yè)，雞腸道微生物群對宿主健康和生長有著顯著的影響，既往的研究已經構建了數萬個雞腸道宏基因組組裝基因組（MAG）。然而，由于短讀長測序和組裝技術的局限性，大多數MAG的質量較低，且包含污染reads。

二、研究方法

選取30只42天齡的嶺南黃肉雞，分別從十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸5個腸室采集150份食糜樣本，進行HiFi宏基因組測序。

三、研究結果

1.HiFi reads可以組裝出較長的contigs

十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸的HiFi reads如下表所示(表1)。HiFi reads的N50長度為17 kb左右。5個腸段初步組裝的contig N50大小均在28kb以上。相比之下，短讀長宏基因組的N50大小通常小于10 kb，這表明HiFi reads在contig連續(xù)性方面有實質性的改進。此外，覆蓋深度與單堿基質量值正相關，表明較高的覆蓋深度會提高序列的精度。

從5個腸段中分別得到了27、40、62、285和334個中等質量的MAGs(圖3A)。分別在菌株和種水平組裝了461和337個MAGs，其中53%和55%是環(huán)狀的。環(huán)狀MAGs checkM評分也更高(圖3B,C)。研究發(fā)現(xiàn)較高的覆蓋深度與checkM完整性評分呈正相關，表明覆蓋深度的提高有利于組裝出更精準的MAGs。

宏基因組中質粒比宿主基因組更難組裝。本研究分別識別出61、67、71、81和78個環(huán)狀質粒基因組。此外，還鑒定到33、14、14、52和50個環(huán)狀病毒基因組。

在原核生物中，rRNA和tRNA基因的鑒定是衡量基因組完整性的重要手段。研究者對461個MAGs中的rRNA和tRNA基因進行注釋，發(fā)現(xiàn)439個(95%)基因組是“RNA完整”的，同時滿足rRNA和tRNA標準。大多數MAGs有1到6個rRNA操縱子(圖4A)和35到65個tRNA基因拷貝(圖4B)。此外，環(huán)狀基因組中rRNA操縱子和tRNA基因的數量更多。

3.HiFi組裝基因組優(yōu)于短讀長組裝的MAGs

本研究發(fā)現(xiàn)的461個菌株水平MAGs中有384個(83%)是新基因組，包括209個(45%)環(huán)狀基因組和175個(38%)非環(huán)狀MAGs(圖5A)。與已報道的種水平MAGs相比，本研究的337個種水平基因組中有89個(26%)是新基因組，包括50個(15%)環(huán)狀基因組和39個(12%)非環(huán)狀MAGs(圖5B)。由于樣本量的限制，目前HiFi組裝的MAGs比短讀長組裝的少，但質量明顯優(yōu)于短讀長MAGs，基因集的完整性也更高，通過與已發(fā)表的兩個短讀長基因集比較，發(fā)現(xiàn)HiFi基因集中有大量的新基因。如圖5所示，HiFi組裝的微生物基因組平均contig數更少、基因組更長、完整度更高、污染程度更低。

使用GTDB-Tk將HiFi組裝的種水平MAGs與GTDB數據庫中的47894個物種簇進行比對、分類學注釋。其中，只有1個MAGs被注釋為古菌，其余336個MAGs均屬于細菌。優(yōu)勢門為厚壁菌門，其次為擬桿菌門和放線菌門，這3個門總共覆蓋了317個(94%)MAGs。

前腸由十二指腸、空腸和回腸組成，主要負責飼料的消化和營養(yǎng)物質的吸收。后腸包含盲腸和結腸，它們的功能是發(fā)酵、解毒和回收殘余的水和鹽。前腸和后腸之間的微生物組成有明顯的差異。前腸高度富集的5個屬:Ligilactobacillus、limmosilactobacillus、乳酸菌、魏斯氏菌和腸球菌。相比之下，后腸的物種多樣性更高。因此，對所有腸段進行分析有利于全面了解腸道微生物。

通過GTDB-Tk注釋，發(fā)現(xiàn)部分MAGs在科、屬和種分類學水平上無法進行分類，這表明它們可能是一些新的菌，可能在工業(yè)或醫(yī)學領域有潛在的價值。近年來，乳酸菌及其近親Ligilactobacillus和Limmosilactobacillus被廣泛用作益生菌補充劑，本次組裝的2個Ligilactobacillus基因組和1個Limmosilactobacillus基因組還沒有注釋到種水平，表明這3個基因組可能為益生菌的發(fā)展提供了新的基因資源。使用核糖體數據庫(RDP)進一步對這些低分類學級別的基因組進行分類，發(fā)現(xiàn)這些基因組中有9個和49個可能分別對應于新的屬和種，這拓寬了人們對微生物世界的認識。此外，這些新發(fā)現(xiàn)的屬中約有1 / 3，新發(fā)現(xiàn)的種中約有一半沒有在短讀長MAG數據中發(fā)現(xiàn)，這表明它們僅來自HiFi宏基因組數據，進一步顯示了HiFi測序在宏基因組研究中的優(yōu)勢。

四、研究結論

HiFi 測序顯著提高了宏基因組組裝質量，也恢復了以前基于短讀長的宏基因組研究中遺漏的大部分新基因組，本研究獲得的新基因組和物種將促進腸道微生物組和宿主-微生物群相互作用研究，從而促進家禽資源的可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻

Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.Gigascience.2022