寫在前面

????????今天推薦的是由中國(guó)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2020年6月26日發(fā)表于Frontiers in Cell and Developmental Biology（2020IF：6.684，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Qingfeng Li教授，研究表明USP15在皮膚傷口修復(fù)過(guò)程中通過(guò)去泛素化EIF4A1增強(qiáng)再上皮化。

研究背景

????????再上皮化是傷口愈合的基本過(guò)程，涉及皮膚屏障重建過(guò)程中的各種細(xì)胞因子和細(xì)胞。泛素特異性肽酶15 (USP15) 是去泛素化酶 (DUB) 的重要成員，可從靶蛋白中去除泛素鏈并保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。然而，USP15在上皮形成中的動(dòng)態(tài)作用仍不清楚。

摘要部分

????????作者旨在研究USP15在再上皮化中的調(diào)節(jié)功能。建立切除傷口夾板模型以評(píng)估USP15敲除 (KO) 小鼠的再上皮化率。進(jìn)行共免疫沉淀 (Co-IP) 和質(zhì)譜分析以鑒定USP15相互作用蛋白。對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行RNA測(cè)序并上傳到NODE數(shù)據(jù)庫(kù)。首先，在USP15 KO小鼠中觀察到上皮化的顯著延遲。此外，在USP15沉默的角質(zhì)形成細(xì)胞 (HaCaTs) 中觀察到細(xì)胞遷移和增殖的抑制。作者首次揭示USP15可以與真核起始因子4A-1 (EIF4A1) 相互作用，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的翻譯效率，這對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移至關(guān)重要。最后，USP15-EIF4A1復(fù)合物顯著加速了傷口愈合中的再上皮化。這些觀察結(jié)果有助于闡明USP15在調(diào)節(jié)傷口愈合過(guò)程中再上皮化的功能和機(jī)制，為難治性傷口治療提供了一個(gè)新的靶標(biāo)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP15基因敲除小鼠的延遲再上皮化現(xiàn)象

????????首先，作者測(cè)試了USP15在人類皮膚組織的全層中的表達(dá)。IF和IHC均顯示USP15蛋白信號(hào)在角質(zhì)形成細(xì)胞中富集，而其他細(xì)胞呈現(xiàn)低USP15表達(dá)。此外，作者的研究中使用了USP15基因敲除小鼠。作者證實(shí)，在USP15敲除小鼠中，角質(zhì)形成細(xì)胞中的USP15蛋白表達(dá)確實(shí)被沉默。隨后作者建立了一個(gè)切除傷口夾板模型，并觀察到Usp15基因敲除小鼠的再上皮化顯著延遲。在傷口愈合過(guò)程中，縫隙會(huì)被角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移而閉合。此外，作者研究發(fā)現(xiàn)USP15敲除小鼠中傷口模型的上皮間隙顯著增加。

研究結(jié)論：USP15基因敲除小鼠的延遲再上皮化現(xiàn)象。

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2.USP15的缺失減弱了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移

????????作者接下來(lái)探究了USP15在角質(zhì)形成細(xì)胞中的調(diào)節(jié)功能。在用shUSP15和陰性對(duì)照 shNC的短發(fā)夾序列轉(zhuǎn)染慢病毒后，作者在轉(zhuǎn)染后觀察到USP15的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低。Transwell測(cè)定表明，在抑制USP15后，通過(guò)8毫米孔轉(zhuǎn)移的上層細(xì)胞減少。傷口愈合試驗(yàn)顯示USP15沉默組的傷口恢復(fù)率顯著延遲。此外，與對(duì)照組相比，USP15敲低組中的細(xì)胞也形成了更少和更小的集落。CCK-8試驗(yàn)證明USP15抑制細(xì)胞的細(xì)胞增殖率受到抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示抑制USP15表達(dá)后S期細(xì)胞百分比降低。不僅如此，與對(duì)照組相比，抑制USP15后S噬菌體百分比下降且G0/G1期百分比增加。更重要的是，與野生型組相比，Usp15 KO皮膚組織的再生角質(zhì)形成細(xì)胞的Ki67陽(yáng)性率降低。

研究結(jié)論：USP15在體外或體內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移中至關(guān)重要。

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3.USP15沉默細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組分析

????????為了進(jìn)一步探索USP15在角質(zhì)形成細(xì)胞中調(diào)控作用的詳細(xì)機(jī)制，作者在USP15抑制后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄篩選。RNA-seq分析表明USP15沉默導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞中425個(gè)基因的上調(diào)和475個(gè)基因的下調(diào)?；虮倔w（GO）分析和Circos圖顯示主要差異表達(dá)基因與表皮過(guò)程相關(guān)，如角質(zhì)化、皮膚表皮發(fā)育和角質(zhì)形成細(xì)胞分化，而上調(diào)基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。京都基因和KEGG分析表明，最高上調(diào)的途徑與免疫和致癌作用的調(diào)節(jié)有關(guān)，而下調(diào)的途徑與感染和代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，通過(guò)基因集富集分析 (GSEA)，作者發(fā)現(xiàn)抑制USP15后翻譯相關(guān)過(guò)程顯著下調(diào)。

研究結(jié)論：USP15沉默細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，USP15抑制后主要差異表達(dá)基因與表皮過(guò)程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、感染代謝、免疫和致癌作用相關(guān)。

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4.USP15與EIF4A1相互作用

????????為了探究USP15在翻譯調(diào)節(jié)中的詳細(xì)機(jī)制，作者進(jìn)行了免疫共沉淀，并通過(guò)銀染鑒定了裂解物。質(zhì)譜分析鑒定了18種可以特異性結(jié)合USP15的蛋白質(zhì)。使用抗USP15在質(zhì)譜中鑒定了這些蛋白質(zhì)。GO分析顯示這些特異性結(jié)合蛋白主要分布在核糖體中。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，作者發(fā)現(xiàn)EIF4A1可能在USP15引導(dǎo)的翻譯調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。此外，蛋白質(zhì)印跡分析證明USP15蛋白可以在抗EIF4A1組中被拉下，這表明EIF4A1和USP15之間存在直接相互作用。此外，在使USP15沉默后，總蛋白USP15已大大減少，且識(shí)別出較弱的相互作用信號(hào)。

研究結(jié)論：USP15與EIF4A1能夠發(fā)生相互作用。

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5.USP15去泛素化EIF4A1并增強(qiáng)其體外和體內(nèi)穩(wěn)定性

????????由于USP15可以與EIF4A1相互作用，作者隨后研究了EIF4A1表達(dá)是否可以受USP15調(diào)節(jié)。作者發(fā)現(xiàn)EIF4A1的mRNA水平在USP15沉默后保持不變。然而，在敲除USP15后觀察到EIF4A1蛋白水平顯著降低。這些結(jié)果表明USP15可以在轉(zhuǎn)錄后水平上增強(qiáng)EIF4A1的表達(dá)。由于USP15是DUB，作者在沉默USP15后測(cè)試了EIF4A1的泛素化水平。正如預(yù)期的那樣，EIF4A1的泛素化水平在抑制USP15后顯著上調(diào)。然后作者在HaCaT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)USP15。作者觀察到USP15表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著增加。此外，作者觀察到EIF4A1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而EIF4A1的RNA表達(dá)保持不變，這表明USP15可以與EIF4A1相互作用并使其去泛素化，從而促進(jìn)EIF4A1蛋白穩(wěn)定性。此外，在USP15-/-小鼠中觀察到EIF4A1的微弱熒光信號(hào)，表明USP15還可以促進(jìn)體內(nèi)EIF4A1蛋白的穩(wěn)定性。

研究結(jié)論：USP15去泛素化EIF4A1并增強(qiáng)其體外和體內(nèi)穩(wěn)定性。

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6.EIF4A1促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移和翻譯

????????EIF4A1是翻譯起始的關(guān)鍵因素；然而，EIF4A1在角質(zhì)形成細(xì)胞中的作用仍不清楚。因此，作者在HaCaT細(xì)胞中用siRNA抑制了EIF4A1的表達(dá)。此外，EIF4A1蛋白水平在沉默EIF4A1后顯著下調(diào)。與對(duì)照細(xì)胞相比，EIF4A1沉默的細(xì)胞呈現(xiàn)出較慢的增殖率并形成更小的集落。另一方面，傷口愈合試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)都表明，敲除EIF4A1后細(xì)胞遷移顯著減弱。

作者隨后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析并證明在使EIF4A1沉默后有319個(gè)上調(diào)基因和356個(gè)下調(diào)基因。這些改變的基因主要參與細(xì)胞饑餓、細(xì)胞骨架/肌動(dòng)蛋白重塑和缺口信號(hào)通路。此外，在干擾EIF4A1后觀察到翻譯過(guò)程的顯著減少，這表明EIF4A1在翻譯中的重要作用。

研究結(jié)論：EIF4A1促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移和翻譯。

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結(jié)論與討論

????????因此，作者的工作旨在研究USP15在再上皮化中的動(dòng)態(tài)功能。USP15主要分布在角質(zhì)形成細(xì)胞中，在USP15敲除(KO)小鼠中觀察到上皮化顯著延遲。此外，在USP15沉默的角質(zhì)形成細(xì)胞中觀察到細(xì)胞遷移和增殖的抑制。作者首次發(fā)現(xiàn)USP15可以與真核起始因子4A-1 (EIF4A1)相互作用并使其去泛素化,從而提高角質(zhì)形成細(xì)胞的翻譯效率。總之，這些觀察結(jié)果有助于闡明USP15介導(dǎo)的傷口愈合過(guò)程中再上皮化調(diào)節(jié)的功能，為難治性傷口治療提供了一個(gè)新的靶標(biāo)。

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原文鏈接：https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00529