第五章??? 核苷酸

第一節(jié)? 核苷酸的結構與組成

堿基

1.結構：核苷與無機磷酸由β-N-糖苷鍵連接而成

2.常見堿基：胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶（5-甲基尿嘧啶）；腺嘌呤，鳥嘌呤

3.修飾堿基：多為堿基的修飾產物或代謝產物。如5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、N6-甲基A、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿酸、二氫尿嘧啶

4.堿基的性質

（1）紫外吸收性質：堿基雜環(huán)上的共軛雙鍵對于紫外線有較強的吸收

（2）水溶性差（疏水性質）

（3）解離：在中性條件下堿基主要以內酰胺的形式存在

（4）含有多個氫鍵供體和氫鍵受體

（5）互變異構：嘧啶環(huán)和嘌呤環(huán)環(huán)上的取代堿基的富電子性質使它們有互變異構

?????????????? 酮式-烯醇式；氨基式-亞氨基式。如果在堿性環(huán)境下，平衡向烯醇式或亞氨基式移動

?????????????? 現有堿基配對基礎建立在全為酮式和氨基式

核苷

1.結構：戊糖和堿基由β-N-糖苷鍵相連

2.構象：堿基在糖苷上的旋轉受到空間位阻的限制

?????? 順勢和反式（堿基是否與戊糖在同一方向上）

?????? 除了Z-DNA，都是以反向的形式構成

3.常見核苷

4.修飾核苷：修飾堿基和戊糖組成的核苷；核糖環(huán)被修飾的核苷以及少數不是以N-糖苷鍵相連的核苷

5.性質：高親水性（核糖基起作用）

核苷酸

1.結構：戊糖羥基發(fā)生磷酸化反應生成

2，核苷單核苷酸

單核苷酸可以通過成酐反應分別形成核苷二磷酸、核苷三磷酸

3.環(huán)核苷酸

某些核苷一磷酸在環(huán)化酶的催化下，形成環(huán)核苷酸，在細胞中主要作為第二信使

cAMP既可以在細菌體內作為一種第二信使，激活多種與糖類分解代謝有關的相關基因表達，也可以在高等生物體內與cGMP一樣，作為激素的第????????????? 二信使

c-dicGMP在多種細菌中作為第二信使，參與生物膜的形成和致病因子的形成

4.構象：具有一定的柔性

5.理化性質

堿基：紫外吸收、互變異構；核糖：易溶于水、旋旋光性；共同決定：兩性解離、等電點；N-糖苷鍵：在酸性環(huán)境中發(fā)生脫堿基反應

第二節(jié)? 核苷酸的功能

1.作為核酸形成的前體

2.充當能量貨幣：ATP（能量貨幣）；GTP（蛋白質合成）；CTP（脂質合成）；UTP（糖類合成）

3.參與信號轉導cAMP、cGMP第二信使；GTP、GDP激活G蛋白

4.作為其他物質的前體：ADP為輔酶I和輔酶Ⅱ的組分；鳥苷酸作為第一類內含子核酶的輔酶

5.參與物質合成

6.作為一些酶的別構效應物

7.調節(jié)基因的表達

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第六章?? 核苷酸的結構和功能

第一節(jié)? 核酸的分類

分為核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸，二者區(qū)別如下：

1.RNA分子中的戊糖是核糖，DNA分子中的戊糖是脫氧核糖

DNA因為是脫氧核糖，所以缺乏反應性的親和性集團——2‘-OH,降低了磷酸二脂鍵自發(fā)水解的速率，提高了DNA的穩(wěn)定性

RNA因為有2‘-OH，親核性較大，非常不穩(wěn)定，常利用其親核進攻性，催化一些生化反應

但tRNA和rRNA非常穩(wěn)定，是因為它們的羥基受到了甲基化修飾，大大降低了2‘-O原子的反應性

2.RNA的第四個堿基為U，DNA第四個堿基為T（U去甲基化）

C可自發(fā)的脫氨基變成U

用T代替U是為了有效的檢測c-u這種突變

3.RNA通常是單鏈，DNA通常是雙鏈

RNA的類別

第二節(jié)? 核酸的一級結構

核酸的多聚核苷酸鏈上所有核苷酸或堿基的排列順序

多聚陰離子復合物

第三節(jié)? 核酸的二級結構

DNA的結構

1.DNA的二級結構有B性，除此之外還有A、Z型

2.穩(wěn)定雙螺旋結構的因素

（1）氫鍵? （2）堿基堆積力（疏水作用力、范德華力）? （3）磷酸核糖骨架上的負電荷中和

3.DNA非標準的二級結構

（1）彎曲：含有成串的A序列或蛋白質作用（TATA盒結合蛋白可導致DNA啟動子區(qū)域彎曲，大腸桿菌cAMP受體結合蛋白可導致乳糖操縱子形成彎曲）；同時有時也可以做DNA修復系統(tǒng)識別損傷的信號

（2）十字形（存在于復制起始區(qū)域和轉錄調控區(qū)域）：充當某種控制DNA復制和基因轉錄的開關

（3）三螺旋：有順式（平行于嘌呤鏈）和反式的結構（反平行于嘌呤鏈）

???????????? 形成三股螺旋可以影響到DNA的復制、重組和轉錄，還可以阻止特定蛋白質與DNA的結合，從而對堿基的表達起調控作用

?????????????? 三股螺旋的形成需要互補的全嘌呤和全嘧啶堿基，還需要呈現鏡像重復，第三條鏈上的C需要質子化才可以與G配對。超螺旋的形成有利于三股螺旋的形成

（4）堿基翻轉：某個堿基出現在雙螺旋之外

????????????? 催化堿基修飾的酶需要堿基通過翻轉才可以對它進行化學修飾，堿基切除修復也是

（5）滑移錯配DNA：重新形成雙螺旋的時候，錯配，形成兩個環(huán)，會導致移框突變

（6）四鏈DNA

RNA的結構

主要形成α螺旋

發(fā)夾結構：包括兩個部分（標準堿基互補序列和雙螺旋兩股互補序列之間未配對的堿基序列組成的環(huán)）

在RNA中常有GU堿基對，有利于形成鏈內雙螺旋

（1）tRNA的二級結構

有不少是修飾的堿基（黃嘌呤、硫脲嘧啶、假尿嘧啶）

構成tRNA的二級結構的要素有：環(huán)、莖、臂。按照從5‘-3‘的順序，4個環(huán)依次是D環(huán)、反密碼子環(huán)、可變環(huán)和TΦC環(huán)；4個莖依次是受體莖、D莖、反密碼子莖和TΦC莖；臂有D臂、反密碼子臂、TΦC臂和氨基酸臂

受體莖是緊靠著氨基酸臂，與tRNA形成氨酰tRNA的地方。且3‘端最后的三個核苷酸總是CCA，與3’端最后一個核苷酸一起，并不參與受體莖，而是構成氨基酸臂。

D環(huán)上有二氫尿嘧啶，反密碼子環(huán)有反密碼子，緊靠反密碼子5‘端的氨基酸總是U緊靠3’端的氨基酸總是嘌呤核苷酸，且總是被烷基化

在反密碼子環(huán)和TΦC環(huán)之間，通常還會有一個可變環(huán)或附加環(huán)，TΦC環(huán)上的Φ指的是假尿苷，核糖體和轉運RNA之間的結合有賴于對TΦC的識別

（2）rRNA的二級結構

原核生物：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA

真核生物：5SrRNA、5.85SrRNA、18SrRNA和28SrRNA

其中5SrRNA在真核生物與原核生物中都有

rRNA在鏈內有大量的互補序列，所以它高度折疊

16SrRNA在進化中只要保證它的二級結構基本不變就行了，不用在意一級結構的變化

（3）mRNA的二級結構

（4）DNA-RNA雜交存在形成的雙鏈：A型雙鏈（DNA復制、轉錄和逆轉錄）

第四節(jié)? 核酸的三級結構

1.DNA的三級結構

主要以兩種形式存在：松弛型和超螺旋

在松弛型下，DNA以B型雙螺旋存在，能量狀態(tài)最低

DNA的超螺旋包括正超螺旋和負超螺旋。正超螺旋是左手螺旋，由DNA雙螺旋過度纏繞形成的；負超螺旋是右手螺旋，由DNA雙螺旋纏繞不足引起的的（易于解鏈，有利于復制、轉錄和重組，）

某些和堿基差不多的多環(huán)芳香族分子（如溴乙錠和吖啶橙）可以插到DNA雙螺旋兩個相鄰的堿基對之間，促進產生正超螺旋。這些分子都是強烈的致癌物質，容易誘發(fā)DNA在復制時發(fā)生突變

2.RNA的三級結構

RNA分子伴侶（非特異性結合蛋白NADP）有利于幫助RNA形成正確的構象，破壞錯誤折疊的RNA分子內部的化學鍵，形成RNA蛋白體復合物，RNA最終形成正確的構想

驅動和穩(wěn)定RNA三級結構的常常是金屬離子和堿性蛋白

常見結構

（1）假節(jié)結構（常參與形成多種核酶和自我剪切的內含子；誘導病毒在翻譯過程中發(fā)生核糖體移框；對于端聚酶來說發(fā)揮活性有重要作用，端聚酶的RNA作為端粒DNA的模板，高度保守的假節(jié)是活性發(fā)生所必須

（2）吻式發(fā)夾：兩個獨立的發(fā)夾結構通過環(huán)之間的堿基配對形成的共軸螺旋。艾滋病病毒的基因組RNA分子上有這個結構

第五節(jié)? 核酸和蛋白質形成的復合物

1.DNA與蛋白質形成的結構

（1）真核生物的核小體

組蛋白：各兩組【H4、H3】、【H2A、H2B】聚集形成八聚體，H1游離在外

保守性最高的是H4，其次是H3，再其次是H2A、H2B。變化最大的是H1（物種特異性）

某些組織中無H1，被其他類型的代替，如鳥類的H5

DNA序列在核小體的選位中十分重要，多分布于GC區(qū)域

在人類細胞中，包裹在核小體外序列的C甲基化程度高于連線DNA

(2)古菌的核小體

HMFA和HMFB??? 短于真核生物

缺乏尾，故古真菌的核小體無法進行各式各樣的化學修飾

（3）細菌的擬核

細菌具有一些小的堿性蛋白（HU、FIS）與核結合，形成擬核

2.RNA與蛋白質形成的復合物

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第七章??? 核酸的理化性質及研究方法

第一節(jié)? 核酸的理化性質

1.紫外吸收：和堿基有關

2.酸堿解離：同核苷酸

3.粘度：結構細長并有一定剛性的大分子粘度更好

4.沉淀：用乙酸鈉來降低溶液極性，用無水乙醇沉淀DNA，用異丙醇來沉淀RNA

5.變性：熱變形（增加分子內能，破壞氫鍵和堿基堆積力）

?????????? 堿變性（易發(fā)生互變異構）

???? 變性引起的改變：紫外吸收增加（堿基被解放）（增色效應）

???????????????????? 增加DNA的浮力密度（互補堿基形成更加致密的結構）

???????????????????? 降低DNA分子的粘度

???? Tm值:DNA雙螺旋有一半發(fā)生變性熱或有一半氫鍵收到破壞時的相應的溫度

6.復性：減色效應

7.雜交：利用核酸分子的變性和復性的性質，對來源不同的核酸片段按照堿基配對規(guī)則形成異源雜鏈，進而對特定對象進行定量、定性分析的技術

???? Southern 印記 （RNA印記）??????? Northern 印記（DNA印記）

8.核酸的水解

（1）酸水解：敏感性：糖苷鍵>磷酸酯鍵>；嘌呤糖苷鍵>嘧啶糖苷鍵

（2）堿水解：RNA特別是mRNA內磷酸二脂鍵對堿異常敏感。DNA對堿不敏感

（3）酶促水解

第二節(jié)? 核酸研究的技術和方法

1.核酸的分離和純化

（1）核酸的抽取

核酸在細胞核中通常以核蛋白的形式存在，可以用不同濃度的鹽溶液進行分離

用酚/氯仿抽取中，核酸溶解在上層水相（DNA位于上層【浮力密度小】，變性之后會略微下

沉【浮力密度變大】【RNA在溶液中的狀態(tài)同變形后的DNA】），蛋白質處于兩相之間的界面

（2）電泳

瓊脂糖凝膠電泳，可以使用溴乙錠染色進行鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳，用放射性自顯影或銀染等方法進行檢測

（3）離心

（4）層析：陰離子交換層析制備核酸；羥基磷石灰分離單鏈DNA；雙鏈DNA;寡聚dt親和層析分離帶有多聚腺苷酸尾的整合生物mRNA

3.核酸一級結構的測定

（1）DNA一級結構測定

? 1）第一代DNA測序

【1】雙脫氧法測序（末端終止法）：通常使用一種經過基因工程改造過的噬菌體DNA聚合酶來催化測序反應，引物是人工合成的寡聚脫氧核苷酸（已被同位素標記）。每組反應使用相同的模板、相同的引物以及相同的dNTP，并且在魅族反應中加入一種適量的2‘，3‘-雙脫氧核苷酸（ddNTP）使其隨機的摻入DNA鏈中。一旦ddNTP進入DNA鏈中，將導致DNA鏈合成的末端終止，產生4組具有特定長度、不同長短的DNA片段，其中每一組內DNA片段以相同的雙脫氧核苷酸結尾，再通過放射自顯影技術自下向上讀出DNA的核苷酸序列（小片段在下，大片段在上）

【2】堿基特異性化學斷裂法

? 2）第二代測序

【1】454Life science焦磷酸測序法

將待測的DNA切成幾百個堿基長度的單鏈片段，每一個片段被固定在一個小珠子上，隨后

使用PCR進行擴增，使每一個珠子上帶有許多相同的DNA，之后加入酶，形成級聯化學發(fā)

光反應，將釋放出來的焦磷酸基團轉化為光信號

以將待測的單鏈DNA作為模板，與特異性的測序引物結合（腺苷-5‘-硫酸磷酸【APS】、熒

光素），再向其中加入4種酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）。再向

反應體系中加入1種dNTP，如果正好可以和下一個堿基配對，就會在DNA聚合酶的催化

下被添加到測序引物的3’端，同時釋放出1分子的焦磷酸（注意：DNA聚合酶對dATPαS的

催化效率高，且dATPαS不作為熒光素酶的底物，故用dATPαS代替dATP.）。在ATP硫酸

化酶的作用下，生成的焦磷酸可以和APS結合生成ATP，在熒光素酶的催化下發(fā)光。經過

電荷偶聯系統(tǒng)，可以得到一個檢測峰，峰值高低和相匹配的堿基成正比。反應體系中剩余的

dNTP和殘留的少量的ATP在雙磷酸酶的催化下發(fā)生降解。再加入另外幾種dNTP，重復操

作

【2】Illumina/Solexa測序

【3】SOLID測序

3）第三代DNA測序

對單分子DNA測序 反應在納米容器中進行（降低背景光，使每個核苷酸發(fā)出的單道光可以被檢測到）；熒光標簽不一定標在參入的脫氧核苷酸上，可能標在釋放出來的焦磷酸基團上。

? 4）第四代DNA測序

利用離子流測序（對于DNA復制合成互補的DNA鏈時，釋放質子，通過對質子的監(jiān)控來實時判讀堿基）（后光測序），測定的是伴隨一個新脫氧核苷酸的參入釋放出來的質子

? 5）單細胞基因組測序

分離出單個細胞，并進行全基因組的擴增（多重取代擴增），然后構建測序文庫，最后使用新一代測序技術進行分析

（2）RNA一級結構的測定

質譜分析或利用反轉錄酶將待測的RNA反轉錄成cDNA