肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，而肝細(xì)胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的大多數(shù)。盡管有一個全面的治療方案，但晚期HCC患者的預(yù)后仍然很差。早期肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，特別是微轉(zhuǎn)移，是HCC治療和預(yù)后改善的巨大難題。深入了解HCC的進(jìn)展機制可能是藥物開發(fā)的關(guān)鍵。環(huán)狀RNA（circRNA）VAMP3驅(qū)動CAPRIN1的LLPS促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中應(yīng)激顆粒的形成，環(huán)狀RNA如何影響LLPS已引起了研究者的廣泛關(guān)注，但是具體的作用機制還需要進(jìn)一步研究。

2023年7月25日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院胃腸外科蔡秀軍/史亮團隊在PNAS（IF=11.1）發(fā)表文章【Cytoskeleton remodeling mediated by circRNA-YBX1 phase separation suppresses the metastasis of liver cancer】。作者研究發(fā)現(xiàn)了一種核環(huán)狀RNA-circASH2，它在HCC組織中最先丟失，并通過改變腫瘤的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)來抑制HCC的轉(zhuǎn)移。原肌球蛋白4（TPM4）是肌動蛋白的一個關(guān)鍵結(jié)合蛋白，是circASH2的主要靶點，并在轉(zhuǎn)錄后被抑制。這種調(diào)控是基于信使RNA（mRNA）/前體mRNA的剪接和降解過程。此外，研究還發(fā)現(xiàn)由circASH2增強的核Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）的液－液相分離增強了TPM4轉(zhuǎn)錄本的衰減。文章揭示了腫瘤抑制的circRNA，并揭示了HCC進(jìn)展的精細(xì)調(diào)節(jié)機制。

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科劉柏強博士、博士研究生沈皓為論文的共同第一作者，蔡秀軍教授和史亮特聘副研究員為本文的通訊作者。研究工作還得到了單革教授團隊的幫助與支持。

circASH2是一種參與HCC轉(zhuǎn)移的circRNA

首先，作者分別對5個高侵襲性HCC組織（HI-HCC）和5個低侵襲性HCC組織（LI-HCC）進(jìn)行circRNA微陣列檢測來分析其表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)一個環(huán)狀RNA,circASH2（hsa_circ_0006302）可能具有腫瘤抑制作用。作者通過circBase數(shù)據(jù)庫、RT-PCR和Sanger測序確定了circASH2的環(huán)化位點。接著作者發(fā)現(xiàn)circASH2在非轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，說明circASH2在HCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，RT-PCR和RNA熒光原位雜交FISH驗證其在HCC組織中低表達(dá)；另外只有沉默DHX9，而不是ADAR1或QKI，增強了circASH2的表達(dá)，從而降低了mASH2，也證實了circASH2的下調(diào)與HCC中過表達(dá)DHX9相關(guān)。綜上所述，circASH2在HCC中具有轉(zhuǎn)移抑制作用，并受DHX9調(diào)控。

cirASH2抑制HCC體內(nèi)轉(zhuǎn)移

作者對cirASH2在肝癌中的功能進(jìn)行研究。通過構(gòu)建三種經(jīng)典的HCC小鼠模型發(fā)現(xiàn)，circASH2過表達(dá)抑制了肝臟多灶性病變和肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，同時也顯著抑制肝轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明，circASH2可以抑制HCC的轉(zhuǎn)移，包括肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、血源轉(zhuǎn)移和植入等。

circASH2破壞了HCC的細(xì)胞骨架組裝

作者通過慢病毒過表達(dá)、小干擾RNA（siRNA）敲低和反義寡核苷酸（ASO）沉默研究circASH2在HCC細(xì)胞中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)circASH2的過表達(dá)可以改變HCC細(xì)胞的粘附功能，強烈抑制腫瘤細(xì)胞中的F-actin和paxillin，破壞細(xì)胞骨架。進(jìn)一步使用Matrigel構(gòu)建了三維（3D）侵襲系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，circASH2可以通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力來削弱腫瘤細(xì)胞，也降低了HCC細(xì)胞的遷移能力。特定ASOs觸發(fā)的circASH2沉默也會損害細(xì)胞骨架組裝，并對HCC細(xì)胞的遷移表現(xiàn)出促進(jìn)作用。總體而言，該研究表明circASH2破壞了HCC的細(xì)胞骨架組裝。

TPM4被circASH2抑制，且與功能相關(guān)

細(xì)胞骨架狀態(tài)與細(xì)胞粘附、病灶黏附形成和遷移率密切相關(guān)。為了闡明 circASH2調(diào)控的細(xì)胞骨架組裝機制，作者對一系列細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。發(fā)現(xiàn)TPM4與HCC預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。在多個細(xì)胞系中進(jìn)行免疫印跡，驗證了circASH2抑制TPM4表達(dá)；在患者樣本分析中，證實了circASH2的表達(dá)水平和TPM4呈負(fù)相關(guān)。表明circASH2對TPM4有負(fù)調(diào)控作用。

作者又通過基因集合富集分析了相關(guān)通路，結(jié)果顯示，在circASH2沉默后，F(xiàn)AK通路、PI3K/AKT通路和ECM-受體相互作用通路被顯著激活。這些信號的激活可觸發(fā)一系列的細(xì)胞生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和侵襲。異位TPM4能恢復(fù)FAK/PI3K/AKT通路，增強細(xì)胞骨架。此外，circASH2抑制細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲，增強了細(xì)胞骨架。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在circASH2敲低細(xì)胞中刪除TPM4時，得出了類似的結(jié)論。結(jié)果表明，circASH2對TPM4有負(fù)調(diào)控作用。

circASH2通過物理連接TPM4轉(zhuǎn)錄本來促進(jìn)mRNA衰變

作者為了剖析circASH2調(diào)控TPM4的機制，首先通過FISH和核-質(zhì)分離確定了circASH2主要分布在細(xì)胞核中?？紤]到TPM4 mRNA和蛋白都被circASH2禁止，作者認(rèn)為circASH2誘導(dǎo)了對TPM4的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。當(dāng)circASH2被調(diào)節(jié)時，觀察到類似的TPM4啟動子熒光素酶活性證實了這一點。FISH檢測發(fā)現(xiàn)，circASH2和TPM4轉(zhuǎn)錄本顯著共定位。

接下來，作者測試了circASH2和TPM4轉(zhuǎn)錄本之間可能的物理相互作用。通過生物素富集分析表明，circASH2不僅可以與TPM4 mRNA結(jié)合，還可以與TPM4 pre-mRNA結(jié)合。而刪除TPM4 mRNA的3‘UTR核苷酸片段（TPM4Δ3’UTR），使TPM4 mRNA與circASH2之間的相互作用明顯受損；CDS結(jié)構(gòu)域的缺失（TPM4ΔCDS）也削弱了兩者之間的結(jié)合。circASH2的突變（circASH2HRmut）完全中止了circASH2和TPM4 mRNA之間的相互作用，減弱了circASH2誘導(dǎo)的降解作用?？深A(yù)見，circASH2HRmut也失去了削弱腫瘤細(xì)胞骨架形成和粘附的能力。結(jié)果表明，circASH2可以特異性靶向TPM4轉(zhuǎn)錄本并干擾其穩(wěn)定性。

circASH2/hnRNP復(fù)合物通過無意義介導(dǎo)衰變（NMD）加速mRNA降解

通過質(zhì)譜分析和基因本體分析發(fā)現(xiàn)，circASH2結(jié)合蛋白與mRNA的剪接和穩(wěn)定顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)一系列與circASH2有顯著結(jié)合的hnRNP，表明circASH2可能通過剪接調(diào)控干擾TPM4轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。為了驗證這一點，作者通過應(yīng)用三種mRNA剪接抑制劑，發(fā)現(xiàn)circASH2誘導(dǎo)的TPM4抑制顯著減弱，且呈劑量依賴性。而經(jīng)歷異常剪接的mRNA傾向于進(jìn)入NMD的過程而不是翻譯過程。進(jìn)一步驗證，使用特異性抑制劑阻斷了NMD通路或者使NMD關(guān)鍵成分缺失，發(fā)現(xiàn)circASH2誘導(dǎo)的TPM4下調(diào)受到了抑制。這些數(shù)據(jù)表明，在HCC細(xì)胞中，circASH2誘導(dǎo)的TPM4下調(diào)依賴于pre-mRNA剪接和NMD過程，其中hnRNPs復(fù)合物作為關(guān)鍵調(diào)控因子。

circASH2/hnRNP誘導(dǎo)的TPM4 mRNA降解依賴于YBX1

MS分析顯示，YBX1是一個眾所周知的RBP，涉及pre-mRNA剪接和mRNA衰減，是circASH2結(jié)合的首選蛋白，通常與細(xì)胞核內(nèi)的hnRNPs協(xié)同作用。在剪接過程中，YBX1可以識別特定的pre-mRNA序列，并招募剪接因子（如hnRNPs）。作者通過circRNA-pulldown免疫印跡、RNA免疫沉淀和共定位染色證實了circASH2和YBX1的相互作用；敲除YBX1完全中止了circAHS2與幾種主要hnRNPs之間的連接；YBX1免疫沉淀成功富集了TPM4 mRNA/pre-mRNA,敲低circASH2后這種富集被破壞；YBX1、circASH2和TPM4轉(zhuǎn)錄本在HCC細(xì)胞核染色圖像中嚴(yán)格重疊。

作者進(jìn)一步研究相互作用機制，發(fā)現(xiàn)circASH2的預(yù)測結(jié)合位點（circASH2YBX1mut）上的突變，在體外內(nèi)都破壞了與YBX1的連接，也導(dǎo)致circASH2功能喪失。進(jìn)一步定位實驗表明，circASH2的61~64nt、80~84nt和526~530nt區(qū)域?qū)BX1的結(jié)合是必不可少的。

YBX1在circASH2/hnRNPs/TPM4軸上具有特征，根據(jù)YBX1敲除試驗和重組YBX1與circASH2體外結(jié)合試驗，作者認(rèn)為circASH2直接與YBX1相互作用，然后招募hnRNPs形成一個功能復(fù)合物調(diào)節(jié)TPM4轉(zhuǎn)錄本剪接。

核內(nèi)YBX1經(jīng)歷了由circASH2增強的LLPS

hnRNPs與LLPS密切相關(guān)，YBX1形成了斑點并與細(xì)胞核中的circASH2和TPM4轉(zhuǎn)錄本重疊，而LLPS抑制劑1,6-己二醇會導(dǎo)致YBX1斑點的分解，YBX1在體內(nèi)經(jīng)歷了LLPS。在體外CTD片段對YBX1的LLPS也是不可或缺的。由此表明YBX1在體內(nèi)外都能發(fā)生LLPS。YBX1的CTD片段作為一個高度無序的區(qū)域，是這種生物過程不可缺少的。

在體內(nèi)，作者發(fā)現(xiàn)在circASH2敲低細(xì)胞中YBX1點的形成減弱，而過表達(dá)的circASH2增加了YBX1點，而circASHYBX1mut沒有這樣做。在體外，circASH2YBX1-GFP分別與circASH2、circPABPC1和tRNA共培養(yǎng)，只有circASH2成功促進(jìn)了YBX1的縮合形成。正交實驗表明circASH2濃度與YBX1的液滴形成呈正相關(guān)。作者研究了YBX1-LLPS是否是circASH2誘導(dǎo)信號和功能的必要條件，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)YBX1保留發(fā)生LLPS的能力并與circRNA結(jié)合時，circASH2才能抑制TPM4的表達(dá)。HCC細(xì)胞骨架染色和消化實驗一致證實，YBX1-LLPS是circASH2誘導(dǎo)信號的先決條件。

綜上所述，circASH2可以加速YBX1 LLPS的發(fā)生，這對circASH2-TPM4信號的傳遞也至關(guān)重要。

總結(jié)

綜上所述，核環(huán)狀RNA circASH2在HCC中表達(dá)下調(diào)，這與癌細(xì)胞經(jīng)常表現(xiàn)出整體環(huán)狀RNA豐度減少相一致。更重要的是，circASH2通過抑制TPM4來重塑腫瘤細(xì)胞骨架，并在體內(nèi)外發(fā)揮顯著的抗轉(zhuǎn)移活性。機制上，circASH2促進(jìn)了核YBX1的LLPS，并通過與hnRNPs組裝復(fù)合物來靶向TPM4轉(zhuǎn)錄本。這種circRNA/YBX1/hnRNP復(fù)合物干擾了TPM4轉(zhuǎn)錄本的剪接，并導(dǎo)致其加速降解。此研究提供了一種環(huán)狀RNA誘導(dǎo)的腫瘤調(diào)控機制，它將細(xì)胞骨架、mRNA剪接和LLPS聯(lián)系在一起。隨著對circRNA相關(guān)藥物的開發(fā)，此研究將有利于未來的肝癌治療。

原文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2220296120?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org&rfr_dat=cr_pub++0pubmed