Vero細(xì)胞起源于1960年代3月27日的正常成年非洲綠猴的腎臟，是微生物學(xué)以及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究（包括涉及對(duì)基因的編輯等研究）中最常用的哺乳動(dòng)物基因細(xì)胞系之一。作為需要CRISPR / Cas9技術(shù)的基因敲除/敲入。在第93代時(shí)，該細(xì)胞系被帶到美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的國(guó)立過敏和傳染病的研究所，并于1966年提供給美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。

Vero細(xì)胞系也是錨固依賴性細(xì)胞系，已廣泛用于病毒學(xué)研究，但也已用于許多其他方面的細(xì)節(jié)觀察，包括細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和寄生蟲的繁殖和研究，以及化學(xué)物質(zhì)，毒素作用的評(píng)估，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞上分子水平的其他物質(zhì)。因此，基因編輯的Vero細(xì)胞，在這些領(lǐng)域的研究中越來越受歡迎。此外，Vero細(xì)胞已在美國(guó)獲得生產(chǎn)活疫苗（輪狀病毒，天花）和滅活（脊髓灰質(zhì)炎病毒）疫苗的許可，并且在世界范圍內(nèi)，Vero細(xì)胞已用于生產(chǎn)其他幾種病毒，包括狂犬病病毒，呼腸孤病毒和日本腦炎病毒。這些研究主要與Vero CRISPR / cas9哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Vero敲除細(xì)胞系，慢病毒包裝和Vero點(diǎn)突變細(xì)胞系有關(guān)。 Vero細(xì)胞也可以用作真核耳寄生蟲（如錐蟲）的宿主細(xì)胞。

圖1. Vero 76細(xì)胞（ATCC＃CRL-1587），約95％單層。這些細(xì)胞將需要在一天之內(nèi)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

Vero細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中生長(zhǎng)良好，并發(fā)現(xiàn)清晰的細(xì)胞膜邊界和良好的細(xì)胞質(zhì)透明度。

Vero細(xì)胞的形態(tài)相對(duì)完整，細(xì)胞增殖速度也相對(duì)較快。將Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)移到燒瓶中后，在培養(yǎng)24小時(shí)后可以粘附。培養(yǎng)三天后，細(xì)胞可以達(dá)到相對(duì)靜止的階段。細(xì)胞可以在培養(yǎng)的第五天長(zhǎng)成單層細(xì)胞，并且可以培養(yǎng)到第十二天。發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)茂密，細(xì)胞開始老化直到第十四天。旋轉(zhuǎn)后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度比旋轉(zhuǎn)前慢，但是單層細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間比旋轉(zhuǎn)前更長(zhǎng)。在支原體檢查期間未發(fā)現(xiàn)支原體生長(zhǎng)和污染。細(xì)胞類型分析結(jié)果表明，Vero細(xì)胞的核型無明顯異常，染色體數(shù)無明顯變化。

Vero細(xì)胞系的應(yīng)用：

Vero細(xì)胞可用于多種研究目的。 Vero細(xì)胞廣泛用于病毒感染的分子機(jī)制研究，疫苗生產(chǎn)和重組蛋白。發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞在建立后不久就對(duì)許多類型的病毒高度敏感，包括猿猴液泡病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒和腺病毒。后來發(fā)現(xiàn)它對(duì)細(xì)菌毒素敏感，包括白喉毒素，不耐熱腸毒素和志賀樣毒素。因此，Vero細(xì)胞適合作為基因定制模型，例如涉及病毒感染的CRISPR敲除細(xì)胞。

1，利用基因敲除的Vero細(xì)胞系提高病毒疫苗的生產(chǎn)

疫苗生產(chǎn)成本高昂，阻礙了全球抗擊疾病的疫苗的采用。本文描述的工作遵循了之前的兩個(gè)出版物，它們報(bào)告了通過對(duì)大規(guī)模疫苗生產(chǎn)中使用的Vero細(xì)胞系進(jìn)行基因修飾來增強(qiáng)脊髓灰質(zhì)炎病毒和輪狀病毒疫苗生產(chǎn)的策略。 CRISPR / Cas9基因編輯工具被用于敲除先前顯示在脊髓灰質(zhì)炎和輪狀病毒生產(chǎn)中起作用的Vero目標(biāo)基因。隨后，開發(fā)了當(dāng)前行業(yè)制造系統(tǒng)的小規(guī)模模型，并采用該模型來評(píng)估多種穩(wěn)定的敲除細(xì)胞系對(duì)脊髓灰質(zhì)炎和輪狀病毒產(chǎn)量的增加。與以前的研究不同，Vero敲除細(xì)胞系未能實(shí)現(xiàn)所需的目標(biāo)產(chǎn)量增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，在脊髓灰質(zhì)炎和輪狀病毒疫苗的生產(chǎn)過程中實(shí)施基因工程改造的Vero細(xì)胞系之前，需要進(jìn)行更多的研究，以便能夠以較低的價(jià)格提供疫苗。

2，基因編輯的Vero細(xì)胞作為輪狀病毒疫苗的底物

輪狀病毒（RV）是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重腸胃炎的主要原因，可導(dǎo)致5歲以下兒童大量與腸胃炎相關(guān)的疾病。口服減毒活減毒RV疫苗可以預(yù)防疾病，但是高制造成本和冷鏈維持通過siR鑒定了病毒細(xì)胞宿主基因的一個(gè)子集。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

?方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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