在世界范圍內(nèi)，肝癌是第六大最常見的癌癥，也是第三大致死癌癥。它最常見于撒哈拉以南的非洲和亞洲東部部分地區(qū)，包括中國、中國香港和中國臺灣。肝癌的類型根據(jù)癌癥起源的細(xì)胞類型分為5類，包括肝細(xì)胞癌（HCC）、肝纖維板層癌、膽管癌、血管肉瘤和肝母細(xì)胞瘤，其中最常見的是肝細(xì)胞癌。

免疫治療已成為肝細(xì)胞癌綜合治療不可或缺的一部分。免疫療法已被證明對早期HCC、晚期HCC或肝移植后HCC復(fù)發(fā)的患者有效。目前有許多不同類型的靶向藥和免疫療法?？茖W(xué)家們目前也在緊鑼密鼓地研究這些藥物的最佳使用方法，以及如何更好地將這些靶向藥與其他治療肝癌的方法結(jié)合使用。這些靶向物如下表所示：

源井生物的KO現(xiàn)貨庫擁有近3000種KO細(xì)胞，覆蓋多種藥物靶點(diǎn)基因，包括上述的PDCD1、CD274、KDR、ERBB3基因，可復(fù)制鏈接入庫搜索>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=16

CRISPR/Cas9在肝癌模型中的應(yīng)用

癌癥涉及多個點(diǎn)突變、易位和染色體丟失與增加，所以確定癌癥中的驅(qū)動基因突變是一個挑戰(zhàn)。因此，為了更全面研究肝癌，有必要對肝癌的發(fā)展進(jìn)行建模，并開發(fā)具有人類疾病特征的肝癌模型。CRISPR/Cas9由于其高效和直接的基因編輯能力，能有效加快這一構(gòu)建過程。癌癥模型大致可分為兩類：體外和體內(nèi)。常見的體外模型是可以無限傳代的肝癌相關(guān)細(xì)胞系。通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除特定基因，模擬肝癌發(fā)展過程中的突變，從而構(gòu)建特定的肝癌模型。體內(nèi)肝癌模型通常使用小鼠構(gòu)建，通過將CRISPR/Cas9系統(tǒng)傳遞到小鼠的特定器官或組織，再經(jīng)誘導(dǎo)致癌突變或染色體重排來構(gòu)建肝癌模型。

肝癌細(xì)胞系由于其轉(zhuǎn)染效率低、單克隆生長困難等特性，在眾多細(xì)胞系中屬于難以培養(yǎng)及編輯的細(xì)胞系。源井生物擁有12年基因編輯經(jīng)驗(yàn)，獨(dú)家研發(fā)CRISPR-UTM技術(shù)，10倍高效地進(jìn)行細(xì)胞系基因編輯，即使是肝癌細(xì)胞（如Hep-G2、HuH7細(xì)胞）也能輕松進(jìn)行編輯！如果您需要構(gòu)建肝癌小鼠模型，源井生物可提供動物實(shí)驗(yàn)級別的高純度、高滴度慢病毒和AAV，快至3周交付！可進(jìn)入我們官網(wǎng)了解詳情>>https://www.ubigene.com/

案例分析

肝細(xì)胞癌治療新靶點(diǎn)SNORD17與P53網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜關(guān)系

腫瘤抑制因子p53在DNA損傷或癌基因異常激活的反應(yīng)中被激活，誘導(dǎo)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞周期阻滯、凋亡和衰老，研究表明p53在HCC的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。許多非編碼RNA在p53信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，包括miRNA和lncRNA，然而小核仁RNA(Small nucleolar RNAs, snoRNAs)在p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用還不太明確。針對這個問題，同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科中心的研究團(tuán)隊(duì)通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)對小核仁RNA SNORD17進(jìn)行編輯，揭示了SNORD17和p53信號通路在肝細(xì)胞癌的中的調(diào)控作用，為肝細(xì)胞癌的治療提供了一個新的潛在靶點(diǎn)。

他們借助GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus database）、Kaplan-Meier分析和?qRT-PCR分析篩選得到了肝細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)且在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)量上調(diào)的的小核仁RNA SNORD17。同時SNORD17在HCC中的高表達(dá)與腫瘤體積增大、血管浸潤呈正相關(guān)，推測SNORD17是在HCC臨床檢測中重要的snoRNA。?為了進(jìn)一步研究SNORD17在肝細(xì)胞癌中的作用，研究人員構(gòu)建了SNORD17基因敲除的Hep G2細(xì)胞（由源井生物提供）和SNORD17基因敲降的SK-Hep1細(xì)胞（圖1 A）。在HCC細(xì)胞系中SNORD17基因的敲除和敲降均可顯著抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和G1/S期轉(zhuǎn)變（圖1 B~E）。流式分選發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞相比，SNORD17基因的敲除和敲降均顯著增加了肝癌細(xì)胞的凋亡（圖1F）。為進(jìn)一步研究SNORD17在HCC生長中的作用，利用HepG2-WT細(xì)胞和HepG2-SNORD17-/-敲除細(xì)胞建立的皮下異種移植瘤模型，結(jié)果顯示，與對照組相比，在HepG2細(xì)胞中敲除SNORD17顯著降低了原位肝腫瘤體積和腫瘤重量（圖1 G）。

為了探索SNORD17促進(jìn)肝癌發(fā)展的分子機(jī)制，研究人員通過mRNA表達(dá)譜檢測、Western Blot?檢測、Luciferase報(bào)告基因檢測、增殖、克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p53可以通過調(diào)控SNORD17的表達(dá)進(jìn)而影響HCC細(xì)胞生長。

綜上所述，SNORD17通過與MYBBP1A結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)移到核質(zhì)，從而抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300調(diào)節(jié)的p53乙?；?。SNORD17在HCC中調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性和活性，增加了p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，有望成為HCC治療的新靶點(diǎn)。同時該項(xiàng)研究也進(jìn)一步證實(shí)了snoRNAs在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，并可作為各種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物，這對后續(xù)的癌癥治療研究也起到了一定的借鑒作用。復(fù)制查看案例詳情>>https://www.ubigene.com/literature/3075.html

CRISPR/cas9介導(dǎo)的NSD1敲除通過NSD1/H3/Wnt10b信號通路抑制HCC的發(fā)展

有研究表明，核受體結(jié)合的SET結(jié)構(gòu)域蛋白1 (NSD1)的體細(xì)胞失調(diào)與HCC的腫瘤發(fā)生有關(guān)，提示NSD1可能是這種惡性腫瘤的預(yù)后靶點(diǎn)。因此，為了研究NSD1如何通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控HCC進(jìn)展，Zhang等研究人員利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建NSD1基因敲除細(xì)胞株，通過肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等一系列實(shí)驗(yàn)研究NSD1基因敲除細(xì)胞株，以及通過染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)研究NSD1基因?qū)M蛋白H3、Wnt10b和Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果表明NSD1基因敲除可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。CRISPR/cas9介導(dǎo)的NSD1敲除促進(jìn)了H3K27me3的甲基化，減少了H3K36me2的甲基化，從而抑制了Wnt10b的表達(dá)。結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號通路的失活抑制了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

CRISPR/cas9介導(dǎo)的外顯子跳躍內(nèi)在激活β-catenin信號有助于HCC中的免疫逃逸

最近有研究通過對臨床樣本的綜合分析，發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞癌(HCC)的分子和免疫學(xué)分類，而CTNNB1 (β-catenin)突變亞型表現(xiàn)出免疫抑制腫瘤微環(huán)境的獨(dú)特特征。為了闡明分子機(jī)制，Masafumi Akasu等研究人員通過修改lentiGuide-Puro質(zhì)粒(Nat方法)，開發(fā)了一種高效的基于多重CRISPR/ cas9的外顯子跳躍基因組工程系統(tǒng)，該系統(tǒng)由張峰實(shí)驗(yàn)室提供。利用該系統(tǒng)首次構(gòu)建了β-catenin外顯子3跳躍突變的人、小鼠肝癌細(xì)胞模型，促進(jìn)核易位，激活Wnt/β-catenin信號通路。基因集富集分析表明，在激活β-catenin信號通路的HCC細(xì)胞中，免疫相關(guān)基因組下調(diào)。通過比較分析野生型和外顯子3跳躍β-catenin的HCC細(xì)胞之間的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞和小鼠肝癌細(xì)胞中，4種細(xì)胞因子的表達(dá)水平普遍降低。373個人類HCC樣本的公開外顯子組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在具有β-catenin熱點(diǎn)突變的HCC腫瘤中，兩種候選細(xì)胞因子基因CCL20和CXCL2顯著下調(diào)。T細(xì)胞殺傷試驗(yàn)和移植腫瘤組織的免疫組化分析表明，小鼠Ctnnb1Δex3肝癌細(xì)胞逃過了免疫監(jiān)測。綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)由β-catenin信號激活控制的細(xì)胞因子可能有助于免疫逃逸，并為β-catenin突變的HCC亞型的癌癥免疫治療提供了新的見解。

源井生物基于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)一步研發(fā)了CRISPR-U?獨(dú)家專利技術(shù)，具有更高的基因編輯效率，目前源井生物已憑借該技術(shù)成功構(gòu)建了擁有近3000種KO細(xì)胞的基因敲除細(xì)胞庫，包括上文提及的相關(guān)基因敲除細(xì)胞系如CTNNB1基因敲除A549細(xì)胞系/CTNNB1基因敲除HEK293細(xì)胞系、WNT10B基因敲除A549細(xì)胞系/ WNT10B基因敲除HEK293細(xì)胞系、SNORD17?基因敲除Hep G2細(xì)胞系等，我們還篩選出NF-kB、Hedgehog、JAK-STAT、MAPK、Notch、PI3K-Akt、TGF-beta、Wnt?共8大熱門信號通路其中近800種關(guān)鍵基因構(gòu)建敲除細(xì)胞系，現(xiàn)一周內(nèi)即可獲得成功敲除的KO細(xì)胞，輕松實(shí)現(xiàn)各類研究！歡迎進(jìn)入我們KO細(xì)胞現(xiàn)貨庫了解詳情>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=16