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鐵死亡（ferroptosis）是一種鐵依賴的、脂質(zhì)過氧化物累積的新型細(xì)胞死亡方式，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關(guān)。自從鐵死亡被發(fā)現(xiàn)以來，就以一己之力掀起研究狂潮，至今熱度不減，儼然成為醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域熱門的研究方向，也是近些年國自然基金熱點(diǎn)資助項(xiàng)目。

今天，小薇跟大家分享一篇“9+”鐵死亡文獻(xiàn)思路，手把手教你鐵死亡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

文獻(xiàn)信息

文章題目：Cetuximab promotes RSL3-induced ferroptosis by suppressing the Nrf2/HO-1 signalling pathway in KRAS mutant colorectal cancer（在KRAS突變型結(jié)直腸癌中，西妥昔單抗通過抑制Nrf2/HO-1信號(hào)通路促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡）

雜志：Cell Death and Disease （IF: 9.865）

研究設(shè)計(jì)

1. 研究西妥昔單抗對RSL3對KRAS突變CRC細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的影響

使用4個(gè)KRAS突變的CRC細(xì)胞株（HCT116、DLD-1、LOVO和SW480）分別用RSL3單獨(dú)或聯(lián)合西妥昔單抗處理24小時(shí)，研究藥物對細(xì)胞存活率的影響。通過存活率結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HCT116和DLD-1細(xì)胞。研究RSL3、西妥昔單抗和二者聯(lián)合處理24小時(shí)后對兩種細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)改變、集落形成能力等的影響。

2. 研究西妥昔單抗對KRAS突變CRC細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的影響

為了研究RSL3和西妥昔單抗是否會(huì)促進(jìn)鐵死亡，在KRAS突變體HCT116和DLD-1細(xì)胞中評估了鐵死亡相關(guān)指標(biāo)，即脂質(zhì)活性氧（ROS）積累、丙二醛（MDA）水平，細(xì)胞內(nèi)的鐵水平等。而且，細(xì)胞內(nèi)加入鐵死亡抑制劑Fer-1、凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、壞死抑制劑necrostatin-1或自噬抑制劑3-MA，研究哪種抑制劑可以抑制RSL3和西妥昔單抗處理對HCT116和DLD-1細(xì)胞生長的抑制。

3. 研究RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理對KRAS突變CRC細(xì)胞中的Nrf2/HO-1軸的影響

Keap1是細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。氧化應(yīng)激后，Keap1與Nrf2分離，導(dǎo)致Nrf2積累，核易位，激活靶基因HO-1的轉(zhuǎn)錄。因此，本研究首先研究了RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理對Keap1、Nrf2、HO-1等蛋白的影響；然后敲除Nrf2，評估Nrf2表達(dá)對西妥昔單抗和RSL3處理KRAS突變CRC細(xì)胞的存活率以及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響。

4. 研究西妥昔單抗是否通過激活p38 MAPK調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1軸

為了研究p38 MAPK在Nrf2/HO-1表達(dá)中的作用，評估了西妥昔單抗和SB202190 （p38的特異性抑制劑）對HCT116和DLD-1細(xì)胞中p38活性、Nrf2和HO-1表達(dá)的影響；研究RSL3、西妥昔單抗和SB202190處理對細(xì)胞存活率的影響。然后，在兩種細(xì)胞中過表達(dá)Nrf2或HO-1，研究過表達(dá)Nrf2或HO-1后對西妥昔單抗和RSL3聯(lián)合處理的細(xì)胞的存活率的影響。

5. 體內(nèi)試驗(yàn)研究西妥昔單抗在體內(nèi)是否能促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

構(gòu)建異種移植裸鼠模型，探討西妥昔單抗在體內(nèi)是否能促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。研究RSL3、西妥昔單抗及二者聯(lián)合處理對腫瘤重量、腫瘤大小、腫瘤體積、體重；體內(nèi)MDA水平；以及Nrf2、HO-1和Keap1蛋白水平的影響。

主要結(jié)果

1. 西妥昔單抗增強(qiáng)RSL3處理對KRAS突變CRC細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

研究發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗處理增強(qiáng)了RSL3對HCT116和DLD-1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（圖1A，B）。與RSL3或西妥昔單抗處理相比，RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理顯著抑制了細(xì)胞增殖（圖1C）。提示西妥昔單抗處理通過顯著抑制細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)RSL3對KRAS突變CRC細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用。

圖1 西妥昔單抗增強(qiáng)RSL3對KRAS突變CRC細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

2. 西妥昔單抗增強(qiáng)KRAS突變CRC細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

采用脂質(zhì)過氧化探針C11-BODIPY581/591檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平，發(fā)現(xiàn)RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理后，脂質(zhì)ROS積累顯著增加（圖2A）、MDA水平顯著升高（圖2B）。西妥昔單抗對HCT116或DLD-1細(xì)胞系的脂質(zhì)ROS積累和MDA水平?jīng)]有影響，但增強(qiáng)了RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS水平和MDA水平的增加（圖2B）。而且，與RSL3單獨(dú)處理相比，RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理的細(xì)胞發(fā)出更強(qiáng)的橙色熒光（圖2C）。此外，RSL3和西妥昔單抗處理增加了對HCT116和DLD-1細(xì)胞生長的抑制，這種效果被鐵死亡抑制劑Fer-1逆轉(zhuǎn)（圖2D）。這些結(jié)果表明，西妥昔單抗能增強(qiáng)KRAS突變CRC細(xì)胞系中RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖2西妥昔單抗治療可增強(qiáng)KRAS突變CRC細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

3. RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理可抑制KRAS突變CRC細(xì)胞中的Nrf2/HO-1軸

Western blot分析顯示，RSL3和西妥昔單抗處理后，Keap1表達(dá)增加，抑制Nrf2/HO-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖3A）。在HCT116和DLD-1細(xì)胞中，siRNA轉(zhuǎn)染48 h可降低Nrf2及其下游靶點(diǎn)HO-1的表達(dá)。與RSL3組相比，RSL3處理的轉(zhuǎn)染組中Nrf2和HO-1水平降低（圖3B）。轉(zhuǎn)染靶向Nrf2的siRNA可以提高HCT116和DLD-1細(xì)胞對RSL3的敏感性（圖3C）。而且，Nrf2敲低提高了RSL3誘導(dǎo)的MDA水平（圖3D）、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平（圖3E）和細(xì)胞內(nèi)鐵積累（圖3F）。這些結(jié)果表明，RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理可抑制KRAS突變CRC細(xì)胞中的Nrf2/HO-1信號(hào)。

圖3 RSL3和西妥昔單抗聯(lián)合處理可抑制KRAS突變CRC細(xì)胞中的Nrf2/HO-1軸

4. 西妥昔單抗激活p38 MAPK并調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1軸

西妥昔單抗或SB202190處理的細(xì)胞中p38蛋白水平與對照組無差異。西妥昔單抗顯著提高p-p38水平，但當(dāng)西妥昔單抗與SB202190聯(lián)合處理時(shí)，這種作用被消除（圖4A）。而且，西妥昔單抗處理降低了Nrf2和HO-1的表達(dá)，而SB202190降低了西妥昔單抗介導(dǎo)的Nrf2和HO-1的抑制（圖4A）。此外，RSL3和西妥昔單抗誘導(dǎo)的HCT116和DLD-1細(xì)胞的死亡被SB202190部分挽救（圖4B）。而且，Nrf2過表達(dá)或HO-1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了西妥昔單抗和RSL3聯(lián)合處理對CRC細(xì)胞的存活率的抑制（圖4D-F)。此外，t-BHQ處理激活Nrf2或hemin處理激活HO-1部分逆轉(zhuǎn)了RSL3和西妥昔單抗處理對HCT116和DLD-1細(xì)胞的生長抑制(圖4G, H)。這些結(jié)果表明p38 MAPK參與調(diào)控Nrf2和HO-1的表達(dá)，西妥昔單抗可以通過p38 MAPK的激活抑制Nrf2/HO-1通路。

圖4 西妥昔單抗激活p38 MAPK并調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1軸

5. 在異種移植裸鼠模型中，西妥昔單抗通過抑制KRAS突變CRC細(xì)胞中的Nrf2/HO-1軸來增強(qiáng)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

在DLD-1異種移植裸鼠模型中，RSL3單獨(dú)和西妥昔單抗和RSL3聯(lián)合治療均可導(dǎo)致腫瘤大小的減小，并且在兩種藥物聯(lián)合治療組中腫瘤大小的減小幅度最大（圖5B-D)。對照組和處理組的體重和每日攝食量沒有顯著變化（圖5E）。然后我們測試西妥昔單抗和RSL3聯(lián)合治療是否能在體內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化。值得注意的是，聯(lián)合組MDA濃度水平顯著提高（圖5F）。Western blot結(jié)果顯示， RSL3和西妥昔單抗共同處理后，Nrf2和HO-1的相對水平降低，keap1的表達(dá)相對增加（圖6A）。免疫組化染色同樣證實(shí)、RSL3和西妥昔單抗共同處理后，Ki67、Nrf2和HO-1低表達(dá)，keap1高表達(dá)（圖6B）。這些體內(nèi)結(jié)果證實(shí)，西妥昔單抗通過抑制Nrf2/HO-1活化來增強(qiáng)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖5 西妥昔單抗在體內(nèi)增強(qiáng)了RSL3和RSL3誘導(dǎo)的ferroptosis的抑制作用

圖6 西妥昔單抗通過抑制Nrf2/HO-1軸在體內(nèi)增強(qiáng)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

以上就是本研究的主要內(nèi)容啦，研究邏輯比較清晰，實(shí)驗(yàn)方法比較常規(guī)，易復(fù)現(xiàn)。希望這個(gè)研究思路能夠給你帶來一些靈感，說不定還能適當(dāng)?shù)倪\(yùn)用到標(biāo)書設(shè)計(jì)中呢，如果覺得這個(gè)思路對你有所幫助，請轉(zhuǎn)發(fā)點(diǎn)贊哦。

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