實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

①根據(jù)實驗需要，如果對特定mRNA進行逆轉錄，則使用Takara公司生產(chǎn)的TB GreenR?Premix?Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（Code No. RR420A）。按照說明書，在冰上配制10 ul反應液，裝于96孔無酶PCR板內(nèi)，每孔反應液體系如下：

表2-7 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應體系

試劑? ? ??使用量

TB Green Premix?Ex Taq（Tli RNaseH Plus）? ? ??5 ul

PCR Forward Primer? ? ??0.2 ul

PCR Reverse Primer? ? ??0.2 ul

DNA模板? ? ??2 ul

RNase Free dH2O? ? ??2.6 ul

?PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer由上海生工公司合成，所有序列為文獻驗證或Primer Bank內(nèi)提供序列，根據(jù)文獻選擇內(nèi)參為GAPDH。內(nèi)參U6和hsa-miR-1293的PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer由銳博生物設計，由于該公司對其具有專利，故不予公開。

②加樣完畢后，貼上無酶PCR封板膜，用PCR刮板器將封板膜緊貼在96孔無酶PCR板上，瞬時離心3?min，確保反應液離心到無酶PCR板底部。如果有多板在無酶PCR板，在板邊緣標注PCR板編號等基本信息，打開CFX Connect PCR儀，進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應，程序設置如下：

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應反應條件

Stage 1：預變性? ? ??1?Cycle? ? ??

95℃? ? ? ?30 sec

Stage 2：PCR反應? ? ? ?39 Cycles? ? ??

95℃? ? ? 5?sec

60℃? ? ??30 sec

Stage 2：熔解曲線分析? ? ??1?Cycle95℃

10 sec? ? ??65℃

5?sec? ? ??95℃

③內(nèi)參為GAPDH，復孔至少設置3個，復孔之間的Cq值極差不應大于0.5，復孔之間Cq取均值?！?/span>Cq為同一DNA模板的目的基因與內(nèi)參GAPDH之間的差值，即△Cq＝Cq目的基因－CqGAPDH。注意在計算前需要先查看復孔值，若復孔值之間差別太大則不可信。△△Cq為同一目的基因的實驗組與對照組之間的差值，即△△Cq＝△Cq實驗組－△Cq對照組。注意對照組內(nèi)也要進行比較計算，以便確定對照組的組內(nèi)差異是否過大，是否可信。以對照組目的基因的RNA相對表達量為1，實驗組目的基因的RNA相對表達量用2^－△△Cq表示。