? ? ? ?溶酶體（Lysosome）是細(xì)胞內(nèi)含有多種水解酶的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)分解、降解細(xì)胞垃圾和細(xì)胞內(nèi)過程中產(chǎn)生的廢物的主要場所。它在細(xì)胞的代謝過程、免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)等多個生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究證實(shí)，人類的多種疾病發(fā)生可能與溶酶體相關(guān)機(jī)制有關(guān)，例如動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、胰腺炎、自身免疫性疾病、溶酶體貯積癥和癌癥等，對這些機(jī)制的深入了解有助于研究靶向溶酶體的治療方法。

? ? ? ?為了研究溶酶體相關(guān)基因功能，通常需要借助CRISPR基因編輯技術(shù)。美國密歇根大學(xué)李明教授課題組利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在全基因組水平篩選到可以通過影響溶酶體功能阻礙RNF152降解的基因TMEM251[1]；Kivanc等通過CRISPR文庫進(jìn)行unbiased的代謝基因篩選，得到了與溶酶體pH環(huán)境相關(guān)的兩個重要代謝通路——膽固醇合成以及鐵攝取[2]。接下來，小源將以近期發(fā)表在Cell期刊的研究為例，帶大家用CRISPR基因編輯技術(shù)打開溶酶體在帕金森癥研究中的新思路。

【CRISPR/Cas9基因編輯TMEM175，探索其與帕金森癥發(fā)病關(guān)聯(lián)】

? ? ? ?浙工大團(tuán)隊(duì)以Parkinson’s Disease-Risk Protein TMEM175 is a Proton-Activated Proton Channel in Lysosomes為題在Cell上發(fā)文，該研究發(fā)現(xiàn)帕金森癥的風(fēng)險基因TMEM175是定位于溶酶體的氫離子激活的氫離子通道，其突變可能是誘發(fā)帕金森癥的關(guān)鍵因素之一[3]。

? ? ? ?TMEM175被鑒定為一個K+通道，介導(dǎo)溶酶體和內(nèi)體膜上的鉀傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)RAW 246.7小鼠巨噬細(xì)胞中溶酶體膜電位和pH。為了確定TMEM175是否在神經(jīng)元來源的細(xì)胞中具有類似的功能，研究者使用CRISPR/Cas9技術(shù)在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中做TMEM175的敲除(圖2A)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在含有10%血清的培養(yǎng)基中，TMEM175 KO SH-SY5Y的溶酶體pH值略高于WT。在Earle平衡鹽溶液(EBSS)中培養(yǎng)3小時后，溶酶體pH值顯著增加，而WT SH-SY5Y細(xì)胞在兩種培養(yǎng)條件下保持溶酶體pH值未顯著變化(圖2B)。考慮到TMEM175在溶酶體中會在多個組織中普遍表達(dá)。在營養(yǎng)培養(yǎng)和寡營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，TMEM175 KO細(xì)胞中溶酶體天冬氨酸蛋白酶(CTSD)和半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B (CTSB)的蛋白水平與WT相比均顯著降低(圖2D)，溶酶體功能產(chǎn)生障礙。在TMEM175的 KO細(xì)胞中，也觀察到溶酶體相關(guān)膜糖蛋白1 (LAMP1)的遷移速度比WT更快，這可能是通過去糖基化或蛋白水解裂解導(dǎo)致的(圖2D)。TMEM175 KO沒有改變LAMP1+溶酶體的數(shù)量(圖2C)。對這些溶酶體酶活性的進(jìn)一步評估顯示，與WT相比，TMEM175 KO的CTSD、CTSB和另一種與帕金森癥相關(guān)的溶酶體水解酶GBA顯著減少20-30%(圖2E-G)。寡營養(yǎng)培養(yǎng)沒有進(jìn)一步顯示W(wǎng)T和KO之間酶活性的降低程度。與WT相比，KO中L-Homopropargylglycine (HPG)標(biāo)記的蛋白質(zhì)降解率降低(圖2H)。

? ? ? ?為了確定TMEM175是否在α-突觸核蛋白聚集中發(fā)揮作用，研究者在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中用shRNA 干擾TMEM175，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)和WB評估它們磷酸化的α-突觸核蛋白表達(dá)量(圖2A)。在14d和21 d培養(yǎng)時，TMEM175表達(dá)量降低了75-80%(圖2B)。經(jīng)PFF處理的TMEM175-KD神經(jīng)元細(xì)胞中，磷酸化α-突觸核蛋白染色顯著增加 2-3倍(圖2C和圖2D)，21d增加1.5倍(圖2G和H)。PFF處理后14天，TMEM175-KD神經(jīng)元的健康細(xì)胞核數(shù)量或代謝活性評估的細(xì)胞活力沒有變化(圖2E)。PFF后21天，存活細(xì)胞減少(圖2I)，可能導(dǎo)致磷酸化α-突觸核蛋白比PFF后14天減少了1倍。重要的是，與對照神經(jīng)元相比，TMEM175的敲低導(dǎo)致α-突觸核蛋白聚集傾向增加，這是α-突觸核蛋白病和帕金森癥發(fā)展的關(guān)鍵因素。

? ? ? ?研究人員在大鼠神經(jīng)元模型系統(tǒng)中研究了TMEM175的功能。研究證實(shí)，TMEM175缺乏導(dǎo)致溶酶體pH不穩(wěn)定，從而進(jìn)一步導(dǎo)致溶酶體催化活性降低，葡萄糖腦苷酶活性降低，溶酶體對自噬體的清除受損，線粒體呼吸減少。此外，大鼠原代神經(jīng)元TMEM175缺失導(dǎo)致外源性α-突觸核蛋白原纖維易感性增加。在α-突觸核蛋白原纖維處理后，發(fā)現(xiàn)缺乏TMEM175的神經(jīng)元磷酸化和洗滌劑不溶性α-突觸核蛋白沉積增加。綜上所述，TMEM175在溶酶體和線粒體功能以及帕金森癥發(fā)病機(jī)制中起著直接的關(guān)鍵作用，并突出了該離子通道作為治療帕金森癥的潛在治療靶點(diǎn)。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Zhang W, Yang X, Li Y, et al. GCAF (TMEM251) regulates lysosome biogenesis by activating the mannose-6-phosphate pathway[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 5351.

[2]?Weber RA et al. Maintaining Iron Homeostasis Is the Key Role of?LysosomalAcidity for Cell Proliferation. Molecular Cell. (2020) 7, 645-655.

[3]?Hu M, Li P, Wang C, et al. Parkinson’s disease-risk protein TMEM175 is a proton-activated proton channel in lysosomes[J]. Cell, 2022, 185(13): 2292-2308. e20.

[4]?Jinna S PE et al. TMEM175 deficiency impairs lysosomal and mitochondrial function and increases α-synuclein aggregation[J]. PANS. (2017)26: 114?(9)?2389-2394.