膿毒癥是由各種病原微生物感染引起的危及生命的臟器功能障礙綜合征。近年來，膿毒癥發(fā)病率逐年升高，成為重癥醫(yī)學(xué)科（intensive care unit，ICU）臨床工作的巨大挑戰(zhàn)，全球每年膿毒癥患病人數(shù)超過1900萬，其中有600萬患者死亡，病死率超25%。致病微生物的快速準確鑒定，對幫助臨床醫(yī)師盡早開展目標性治療及優(yōu)化藥物治療方案尤為重要，是改善患者預(yù)后、降低病死率的重要保障。但由于臨床診斷技術(shù)層面的局限性，常有40%~50%的膿毒癥患者不能明確病原微生物，導(dǎo)致初始治療延遲或失敗，病死率顯著增加。

長期以來，微生物培養(yǎng)一直是膿毒癥診斷和療效監(jiān)測的常規(guī)病原學(xué)診斷技術(shù)，但該技術(shù)存在缺點：臨床實驗室一般只能進行細菌/真菌培養(yǎng)，并且培養(yǎng)周期較長（3~7 d）；且培養(yǎng)陽性率低（30%~40%）。雖然可以通過反復(fù)培養(yǎng)增加陽性概率，但同時也增加了患者經(jīng)濟負擔(dān)，并可能延誤正確治療的時機?；诰酆厦告準椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的病原學(xué)檢測技術(shù)只能對已知病原微生物進行檢測，其結(jié)果的解釋高度依賴臨床經(jīng)驗，可能對結(jié)果的準確性造成影響。血清降鈣素原、C反應(yīng)蛋白及內(nèi)毒素等分子標志物在膿毒癥診斷中有一定價值，但這些指標受多種因素干擾且不能明確具體病原微生物，對于臨床抗菌藥物選擇指導(dǎo)價值有限。因此，以上常規(guī)診斷方法存在敏感度低、時效性差、誤差大和鑒定信息不全等缺點，且往往對臨床未知或罕見的病原微生物無法識別。因此，迫切需要一項快速、準確、經(jīng)濟的方法可同時鑒定各種臨床病原微生物的技術(shù)普及實施于臨床。

一、高通量測序技術(shù)

近年來，新興的高通量測序技術(shù)（又稱二代測序技術(shù)）可以使病原體在檢測前不需培養(yǎng)分群即可直接測序鑒別，具有檢測速度快、準確率高、覆蓋范圍廣等特點，并越來越多地應(yīng)用于臨床，顯示出良好的臨床實用發(fā)展趨勢。高通量測序技術(shù)主要是將通用接頭連接到要測序的片段化基因組DNA，然后使用不同的方法產(chǎn)生數(shù)千萬的單分子多克隆聚合酶鏈反應(yīng)陣列，然后進行大規(guī)模的引物雜交及酶延伸反應(yīng)，這些反應(yīng)可以在幾十萬甚至幾百萬的序列上同時進行，并且可以同時檢測反應(yīng)后每個步驟產(chǎn)生的信號，通過計算機分析獲得完整的DNA序列信息。此外，它還可以對膿毒癥合并血流感染患者血液中的血漿游離DNA進行無偏序分析，這被證實可以用于血流感染的診斷。

二、高通量測序技術(shù)檢測膿毒癥病原體的優(yōu)勢

1．測序通量高、敏感度較高

與PCR診斷技術(shù)相比，高通量測序技術(shù)無需特定的引物設(shè)計，直接提取標本中的全部核酸片段并加以檢測，經(jīng)生物信息學(xué)分析即可鑒定出標本中所含核酸的種類，并可獲得病原體的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)，識別臨床常見和罕見感染性菌株或突變株，最大程度地避免了漏檢。與常規(guī)微生物測定結(jié)果相比，在鑒定某些病原體（人類偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、嗜麥芽單胞菌、人類皰疹病毒6型和巨細胞病毒）方面顯示出了100%的敏感度，顯著提高了病原體檢出率。

Long等對ICU的78例膿毒癥患者血漿樣本進行高通量測序和血培養(yǎng)兩種方法檢測分析，并選擇10名健康志愿者的血漿樣本作為陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，就細菌/真菌而言，8份標本測序及培養(yǎng)均陽性，3份標本測序陰性而培養(yǎng)陽性，9份標本測序陽性而培養(yǎng)陰性，總診斷敏感度由培養(yǎng)的12.8%（10/78）提高到高通量測序的30.8%（24/78）。在Parize等的前瞻性研究中，比較了高通量測序技術(shù)和常規(guī)微生物檢測方法在免疫缺陷成年人感染中的應(yīng)用情況，對其血樣和部分鼻咽拭子及體液樣本進行分析，并對患者進行了30 d的隨訪，研究結(jié)束時對兩種方法的結(jié)果進行了與臨床相關(guān)的病毒和細菌檢出率的評估，發(fā)現(xiàn)在納入的101例樣本中，72例樣本使用兩種檢測方法的結(jié)果一致，但高通量測序技術(shù)檢測到臨床相關(guān)的病毒和細菌的比例明顯高于常規(guī)方法。

2．早期識別病原體，時間短

基于測序技術(shù)的臨床宏基因組學(xué)，不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，直接獲取臨床樣本（血液、腦脊液、肺泡灌洗液、尿液等），應(yīng)用高通量測序分析臨床樣本中微生物的DNA或RNA含量與豐度判斷病原菌，利用生物信息分析軟件全面鑒定細菌、病毒、真菌、寄生蟲。因此，該技術(shù)可一次性對幾百萬到幾十億條DNA分子進行并行測序，檢測種類可覆蓋上千種病原微生物，通常在2~3 d得出檢測結(jié)果，獲得疑似致病微生物的種屬信息。

3．檢測特殊病原體，彌補傳統(tǒng)檢測技術(shù)缺陷

高通量測序技術(shù)在病原微生物檢測應(yīng)用方面具有獨特的優(yōu)勢，可實現(xiàn)對未知疾病相關(guān)微生物的快速鑒定，已經(jīng)成功應(yīng)用于H1N1病毒基因組的發(fā)現(xiàn)和腺病毒分型等。Abril等首次通過高通量測序技術(shù)在膿毒癥休克患者血漿中檢出犬咬二氧化碳嗜纖維菌，并通過血培養(yǎng)和16S rRNA測序證實。真菌感染導(dǎo)致的膿毒癥不斷增加，但基于培養(yǎng)的檢測方法具有一定的局限性。Decker等納入50例膿毒癥休克患者，連續(xù)使用真菌培養(yǎng)、高通量測序、血漿中β-D-葡聚糖等方法進行檢測，結(jié)果提示高通量測序技術(shù)適合用于真菌膿毒癥患者和血培養(yǎng)陰性患者的真菌鑒定，可以一定程度上彌補傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)的缺陷。波瓦桑病毒是一種新的由蜱蟲傳播的黃病毒屬的嗜神經(jīng)性RNA病毒，Piantadosi等通過高通量測序快速識別引起重癥中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的該病原體，并通過血清學(xué)檢測得到驗證。1例神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體感染的患者在6周內(nèi)進行了38項感染病原相關(guān)檢測（包括腦組織活檢），均未發(fā)現(xiàn)病原體，但通過腦脊液的高通量測序檢測，48 h后得出檢測結(jié)果為鉤端螺旋體序列數(shù)475條（測序序列數(shù)占比為0.016%），并通過PCR和血清學(xué)檢測進一步確認了該患者罹患鉤端螺旋體感染。

豬皰疹病毒又稱為偽狂犬病毒，以豬為天然宿主，在人類中雖有疑似病例報道，但卻沒有確診病例。最近趙偉麗等報道的基于北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科牽頭的腦炎多中心臨床登記研究，收集4例疑似豬皰疹病毒腦炎病例，對2例患者進行腦脊液高通量測序，檢測到豬皰疹病毒，其他病原體核算檢測均為陰性，并對其中3例患者進行血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)豬皰疹病毒抗體均為陽性，證實了豬皰疹病毒腦炎診斷。復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院張文宏團隊[21]通過高通量測序檢測并確診1例玻璃體中存在豬皰疹病毒感染的眼內(nèi)炎，得到PCR和血清學(xué)試驗驗證，并揭示了豬相關(guān)污染物暴露與豬皰疹病毒感染的可能相關(guān)性。由此證實了高通量測序技術(shù)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和眼內(nèi)炎的快速精準診斷價值。

肺孢子蟲肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）是免疫功能低下患者的常見感染，病死率高，早期快速診斷對患者預(yù)后至關(guān)重要。Zhang等報道了13例高通量測序鑒定出肺孢子蟲，并且經(jīng)臨床評估證實肺孢子蟲肺炎診斷的患者，其中，8例肺泡灌洗液標本中僅有4例Wright-Giemsa染色結(jié)果陽性，13例患者僅有1例痰標本鏡檢陽性。該作者認為，與常規(guī)方法相比，高通量測序診斷PCP的陽性率令人滿意，并且該作者尤其強調(diào)，3例無法承受或拒絕支氣管鏡檢查的患者，通過鑒定外周血樣品中的卡氏肺孢子蟲測序讀數(shù)，被診斷為PCP，這表明高通量測序可能被視為未來診斷PCP的非侵入性工具。

臨床工作中，如遇到病原學(xué)診斷不明或高度懷疑特殊病原體感染的患者，使用常規(guī)檢驗方法難以有效查出病原體，則可考慮送檢高通量測序檢查。依據(jù)筆者經(jīng)驗，條件允許可采集血液標本與感染部位標本一并送檢，如二者高通量測序檢查均查見相同病原體核酸，指導(dǎo)價值較高。

三、高通量測序技術(shù)檢測膿毒癥病原體中存在的問題

1．難以有效分辨致病菌和背景菌

盡管高通量測序技術(shù)敏感度較高，但其檢測結(jié)果往往難以有效區(qū)分污染菌、定植菌還是真正的致病微生物。高通量檢測結(jié)果是一個病原體列表，可能同時呈現(xiàn)多項陽性結(jié)果，臨床醫(yī)師難以僅僅依靠測序結(jié)果確定真正的病原菌，因此，檢測結(jié)果需要跨學(xué)科的全方位解讀。Grumaz等通過序列數(shù)絕對值及偏離正常的程度計算"膿毒癥導(dǎo)向量化指數(shù)"（Sepsis Indicating Quantifier score，SIQ score），對每個樣品中檢測到的每一個微生物進行定量和概率評估，協(xié)助判斷。該研究團隊目前正在嘗試進行大樣本的前瞻性多中心研究來進一步驗證SIQ的臨床價值。

2．技術(shù)和數(shù)據(jù)庫的標準化問題

高通量測序技術(shù)在我國臨床病原診斷中尚未普及，現(xiàn)有檢測機構(gòu)的測序方法，不僅生物信息算法存在差異，并且所用的數(shù)據(jù)庫也有所不同，導(dǎo)致在病原菌鑒定以及相對豐度計算方面出現(xiàn)差別。在高通量測序技術(shù)生物信息分析流程缺乏統(tǒng)一標準的情況下，研究人員基于個人經(jīng)驗、可及性以及簡便性選用分析軟件，會對病原檢測結(jié)果的可重復(fù)性及準確性造成影響，成為高通量測序臨床應(yīng)用標準化的障礙。

3．難以有效監(jiān)測耐藥基因

對于細菌或真菌感染，病原體耐藥基因檢測有助于臨床醫(yī)師根據(jù)患者病原體耐藥和病情進展制訂個性化治療方案。但目前研究中檢測到的細菌、真菌的基因組覆蓋率較低，大多情況下并不能有效檢測耐藥基因，僅有少數(shù)含菌量很大的樣本或者對培養(yǎng)出的菌落進行測序才能較好地檢測到耐藥基因。另外，細菌的耐藥基因型與表型未必一致，因此臨床用藥仍需要經(jīng)驗性選擇，或參考藥敏試驗結(jié)果。高通量測序技術(shù)對耐藥基因的檢測仍是目前研究的熱點和難點問題。

4．價格昂貴

高通量測序技術(shù)作為新型的基因檢測技術(shù)，技術(shù)更新速度快，尚缺乏完善的標準規(guī)范管理和適用于臨床的消費監(jiān)管體系。目前的檢測費用近4000元/樣本，遠高于臨床常用的其他病原學(xué)檢測技術(shù)價格。

四、展望

高通量測序技術(shù)用于膿毒癥病原微生物檢測正處于臨床應(yīng)用的發(fā)展階段，有廣闊的臨床應(yīng)用空間，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)。如標本的規(guī)范化采集、生物信息分析流程的參考標準、檢測報告的專業(yè)性解讀及檢測結(jié)果如何指導(dǎo)臨床治療等問題。但該檢測技術(shù)一直朝著積極的方向發(fā)展，臨床醫(yī)師應(yīng)在認識到高通量測序的臨床使用價值及復(fù)雜性的前提下，積極開展規(guī)范化的臨床應(yīng)用研究，使該技術(shù)能夠成為膿毒癥及感染病原學(xué)早期診斷的可靠工具，促進精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

【引用本文】: 許娜娜, 周敏, 尹梅, 等. ?高通量測序技術(shù)在膿毒癥病原微生物檢測中的價值 [J/CD] . 中華重癥醫(yī)學(xué)電子雜志,2019,5( 2 ): 199-202. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2096-1537.2019.02.021