在癌癥的發(fā)展過程中，營養(yǎng)受限的情況很常見。細(xì)胞葡萄糖水平和細(xì)胞存活的協(xié)調(diào)是細(xì)胞生物學(xué)中的一個基本問題，目前尚未完全了解。已知4EBP1是一種翻譯抑制因子，通過控制翻譯起始來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和存活。然而，除了翻譯抑制功能外，4EBP1是否還通過其他機(jī)制參與腫瘤的生存，尤其是在葡萄糖饑餓條件下仍然未知。2022年12月27日，來自南昌大學(xué)的王建斌教授研究團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Disease雜志（IF 9.685）上在線發(fā)表了題為“4EBP1 senses extracellular glucose deprivation and initiates cell death signaling in lung cancer”的研究論文，該研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（青蓮提供技術(shù)支持）揭示了4EBP1作為一種新的細(xì)胞葡萄糖傳感器在葡萄糖饑餓條件下調(diào)節(jié)癌細(xì)胞死亡的新機(jī)制，這與它作為翻譯抑制因子的經(jīng)典功能不同。

研究背景

為了獲得足夠的能量和代謝物來支持細(xì)胞的快速生長和增殖，癌細(xì)胞會進(jìn)行代謝重編程。葡萄糖是關(guān)鍵營養(yǎng)素之一，癌細(xì)胞吸收和代謝葡萄糖的程度遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。在實(shí)體瘤的快速增殖過程中，由于血管生成不足，腫瘤的中心區(qū)域總是出現(xiàn)葡萄糖供應(yīng)不足。葡萄糖饑餓?(GS)?可根據(jù)遺傳、表觀遺傳和環(huán)境線索觸發(fā)不同癌細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡、壞死、自噬或細(xì)胞生長停滯。然而，細(xì)胞如何應(yīng)對這些細(xì)胞外變化以及葡萄糖剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制尚未完全確定。

研究結(jié)果

GS誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中4EBP1的去磷酸化和穩(wěn)定

為了探究中心區(qū)腫瘤細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，作者分離了來自兩名肺腺癌患者的腫瘤中心區(qū)和外周區(qū)，并進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，與腫瘤外周區(qū)域相比，腫瘤中心區(qū)域有377種蛋白質(zhì)上調(diào)，275種蛋白質(zhì)下調(diào)（圖1A）。對上調(diào)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)長壽調(diào)節(jié)通路在前20個信號通路中富集比最高，且變化顯著（圖1B）。有趣的是，在該通路中4EBP1基因差異最大。4EBP1在腫瘤周邊區(qū)域的蛋白表達(dá)幾乎檢測不到，而4EBP1在中心區(qū)域顯示出相對高的表達(dá)，WB也驗(yàn)證了該結(jié)果（圖1C）。因此，作者懷疑4EBP1可能在腫瘤中心區(qū)域的細(xì)胞死亡進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外中心區(qū)域的葡萄糖水平遠(yuǎn)低于外周區(qū)域（圖1D），因此作者研究了4EBP1是否可以響應(yīng)NSCLC中的GS。結(jié)果表明GS降低了4EBP1的磷酸化水平并通過抑制其K48連接的泛素化穩(wěn)定了4EBP1。

PTPMT1在GS條件下去磷酸化并穩(wěn)定4EBP1

為了進(jìn)一步闡明GS下4EBP1的調(diào)控機(jī)制，作者通過質(zhì)譜分析找出4EBP1的磷酸酶。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，PTPMT1與4EBP1間具有相互作用（圖2A），并且在GS下這種相互作用增強(qiáng)（圖2B）。進(jìn)一步檢查了Phos-Tag凝膠上4EBP1的磷酸化水平。圖2C顯示過表達(dá)PTPMT1降低了4EBP1的磷酸化，表明PTPMT1是4EBP1的磷酸酶。接下來，作者檢測了PTPMT1對4EBP1表達(dá)的影響。過表達(dá)PTPMT1上調(diào)了4EBP1的表達(dá)水平（圖2D），而敲低PTPMT1降低了4EBP1表達(dá)水平（圖2E）。接下來檢測了當(dāng)PTPMT1過表達(dá)時，A549細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中4EBP1的蛋白水平。有趣的是，總的4EBP1和低磷酸化的4EBP1的蛋白水平在細(xì)胞質(zhì)中顯著增加，而在細(xì)胞核中僅略有下降(圖2G)。這些結(jié)果表明，PTPMT1與4EBP1相互作用，然后在細(xì)胞核內(nèi)使4EBP1去磷酸化，導(dǎo)致4EBP1移位到細(xì)胞質(zhì)中。此外還檢測了在GS條件下PTPMT1基因敲除后4EBP1的泛素化和蛋白水平。結(jié)果顯示，PTPMT1基因敲除可以恢復(fù)4EBP1泛素化水平的降低(圖2O)，并減弱GS誘導(dǎo)的4EBP1蛋白上調(diào)(圖2P)。綜上結(jié)果表明，PTPMT1通過阻止4EBP1在GS條件下被泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解，使4EBP1去磷酸化并穩(wěn)定。

4EBP1在GS條件下通過失活STAT3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)一系列抗細(xì)胞凋亡基因（bclxl、bcl2、Survivin、MCL-1等）以介導(dǎo)細(xì)胞存活。STAT3在Y705位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致其二聚化、核轉(zhuǎn)位、DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始。因此，作者評估了p-STAT3-Y705在肺癌中心區(qū)和周邊區(qū)的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤周邊區(qū)域相比，中心區(qū)域的p-STAT3蛋白水平較低(圖3A),與4EBP1的蛋白水平完全相反，表明4EBP1可能與STAT3相關(guān)。進(jìn)一步研究了4EBP1被敲低時p-STAT3-Y705在A549細(xì)胞中的表達(dá)(圖3C),結(jié)果表明，在GS條件下，敲低4EBP1使STAT3的磷酸化水平增加。有趣的是，當(dāng)4EBP1被敲低時，p-STAT3-Y705和STAT3在細(xì)胞核中的表達(dá)增加，而在GS條件下，STAT3的蛋白水平在細(xì)胞質(zhì)中降低(圖3D)。這些數(shù)據(jù)表明，在GS條件下，敲低4EBP1可誘導(dǎo)STAT3從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的磷酸化和易位，并促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)。

4EBP1在體內(nèi)GS條件下抑制腫瘤進(jìn)展

為了闡明4EBP1在腫瘤進(jìn)展中的作用，作者構(gòu)建了4EBP1基因敲除的A549穩(wěn)定細(xì)胞系(A549-sh4EBP1)，并進(jìn)行了異種移植實(shí)驗(yàn)。MTT測定顯示，由GS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡在A549-sh4EBP1細(xì)胞中被挽救（圖4B），形態(tài)學(xué)觀察也得到類似結(jié)果（圖4C）。流式細(xì)胞儀分析表明，在GS條件下，A549-sh4EBP1細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯低于親本A549細(xì)胞(圖4D)。與親本A549細(xì)胞相比，A549-sh4EBP1細(xì)胞的移植瘤大小和重量都有所增加(圖4E，F(xiàn))。為了證實(shí)上述結(jié)果，采用免疫組織化學(xué)方法檢測了腫瘤中心葡萄糖供應(yīng)不足區(qū)域的細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。與親本A549細(xì)胞移植瘤中心區(qū)相比，A549-sh4EBP1細(xì)胞移植瘤中心區(qū)p-STAT3-Y705及抗凋亡基因顯著增加，表明了4EBP1基因敲除的異種移植瘤細(xì)胞凋亡減少。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，4EBP1抑制了GS條件下的腫瘤進(jìn)展。

小結(jié)

該研究首次發(fā)現(xiàn)4EBP1在葡萄糖饑餓條件下可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的死亡。葡萄糖饑餓誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞總4EBP1蛋白表達(dá)上調(diào)，并伴隨由高磷酸化狀態(tài)向低磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。PTPMT1(磷酸酶)在此過程中去磷酸化并穩(wěn)定4EBP1。此外，4EBP1與STAT3(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3)相互作用，阻止JAK或ERK磷酸化和激活STAT3，導(dǎo)致抗凋亡基因的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)闡明了4EBP1在葡萄糖饑餓條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞活力的關(guān)鍵作用。該研究為腫瘤治療提供了一種新的治療策略，即激活PTPMT1去磷酸化4EBP1，從而導(dǎo)致腫瘤核心區(qū)域的細(xì)胞凋亡。