穩(wěn)轉(zhuǎn)建系，是很多基因功能研究繞不過的實驗。常見穩(wěn)轉(zhuǎn)株的兩種篩選方式：流式分選和抗性藥物篩選。流式分選依賴流式細胞儀，所以藥篩是不少實驗萌新的首要選擇。然而，在勤勤懇懇選好轉(zhuǎn)染工具，好不容易得到較好轉(zhuǎn)染效率的陽性細胞后，因為后面的藥篩細節(jié)不到位，導(dǎo)致結(jié)果差強人意的不在少數(shù)。到底是哪里出了問題呢？漢恒小編為大家整理了一篇詳細的藥篩Protocal，供大家參考。

1、常用的藥篩抗生素種類及溶解保存:

嘌呤霉素(Puromycin)；新霉素/G418(Neomycin)；殺稻瘟菌素（Blasticidin）；潮霉素B(HygromycinB)；博來霉素(Zeocin/bleomycin)。

①以水為溶劑的抗生素貯存液應(yīng)使用0.22um濾器過濾除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液無須過濾除菌；③所有抗生素貯液都應(yīng)避光保存；④抗生素配置完成后，都需要分裝成小份，方便取用，避免反復(fù)凍融。

2、殺死曲線（kill curve）建立

抗生素的有效篩選濃度與細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處周期等有關(guān)，確定抗生素殺死未轉(zhuǎn)染細胞的最低工作濃度至關(guān)重要。下面以嘌呤霉素為例：

Day1：準備24孔板，鋪板目的細胞，第二天細胞匯合度應(yīng)在50%～60%；

Day2：加入不同濃度梯度的嘌呤霉素，同時設(shè)置不加嘌呤霉素的對照組細胞，分別設(shè)置3個平行，排除其余干擾因素。具體梯度設(shè)置可以參考相關(guān)文獻，或直接設(shè)置幾個梯度，如：0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL；

Day3-4：每隔一天更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，嘌呤霉素的篩選至少需要48 h（一般能殺死90%以上的細胞），有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2～10天。

制作殺死曲線，選取48h內(nèi)可殺死90%細胞的最低濃度作為后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選工作濃度。

3、穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選

Day1：細胞轉(zhuǎn)染攜帶抗性基因的質(zhì)粒/病毒48-72h后，在細胞匯合度在60%～70%時（細胞太密可先行傳代，等待細胞貼壁再繼續(xù)后面的篩選），在培養(yǎng)基中加入上述確定的工作濃度抗生素，同時設(shè)置空白細胞對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)?；虿《镜龋?；

Day2-3：篩選至少48h，當(dāng)空細胞加抗生素組死亡率＞90%，將含藥篩抗生素培養(yǎng)基撤換為新鮮完全培養(yǎng)基，此時實驗組剩下的基本可以認為是陽性細胞；

Day4～：對篩選的陽性細胞進行繼續(xù)篩選和擴增（隔代加藥維持陽性細胞率，維持濃度為工作濃度的一半，或根據(jù)空白細胞生長速度及細胞狀態(tài)調(diào)整），進行細胞保種與復(fù)檢。

至此即得到了混合克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

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