單個疾病的生信沒新意，可以分析雙疾??！?

同理，單一熱點已經(jīng)看膩了，可以通過雙熱點創(chuàng)新升級！

還有分析鐵死亡和EMT狀態(tài)的方法等你來看！

小云之前推薦的雙疾病思路大家都很感興趣。

這次小云再強力推薦雙熱點的分析思路，希望給你的國自然課題助力！

因為不論是實驗還是生信文章，雙熱點都要比單一熱點要增色不少。那么從生信出發(fā)就分析雙熱點，篩選出關(guān)鍵基因，后續(xù)設(shè)計“雙熱點”的課題思路也就水到渠成了~?

（不知道如何找雙熱點或創(chuàng)新升級的可以找小云，各種個性化分析思路等你來挑~）

雙熱點的生信思路有哪些優(yōu)勢呢？

1.?單一熱點的風(fēng)險評分比較常見，雙熱點會給人眼前一亮的感覺；

2.?大多數(shù)熱點方向都已經(jīng)有生信文章發(fā)表了，比如鐵死亡、氧化應(yīng)激、EMT，突破較難，雙熱點就可以輕松創(chuàng)新升級；

3.?后續(xù)的課題思路依然可以設(shè)計成雙熱點~

小云覺得雙熱點是個不錯的分析思路，而且熱點/潛在的熱點方向那么多，能做的分析思路太多了，建議大家快速上車，先拿下1-2篇生信文章，再設(shè)計后續(xù)“雙熱點”的課題思路。

不過也要注意，不是隨便兩個熱點就能進行分析了，它們之間還是要有一定關(guān)聯(lián)的，比如小云今天分享的這篇的“鐵死亡”和“EMT”的雙熱點生信文章。

研究表明，EMT過程中ZEB1的激活促進了多不飽和脂肪酸(PUFA)的合成，而PUFA的代謝依賴于GPX4。這使得腫瘤細(xì)胞容易受到鐵死亡的影響。HDAC抑制劑治療可以誘導(dǎo)EMT，并通過改變細(xì)胞內(nèi)鐵水平來增加對鐵死亡的敏感性。這些研究都說明了”鐵死亡”和“EMT”之間存在潛在聯(lián)系。

那么，同時分析這兩個熱點，形成雙熱點生信思路就手到擒來了！趕快來看看吧~

題目：基于鐵死亡和EMT狀態(tài)的肝細(xì)胞癌預(yù)后預(yù)測和免疫浸潤分析

雜志：Frontiers in immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時間：2022年12月

研究思路

從TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫下載肝癌患者的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)，分別用于預(yù)后模型的構(gòu)建和驗證。采用最小絕對收縮和選擇算子(LASSO) Cox回歸構(gòu)建預(yù)后模型，通過Kaplan-Meier生存分析和受試者工作特征(ROC)曲線評估模型的預(yù)測能力。通過表達(dá)譜分析評估鐵死亡和EMT狀態(tài)。采用CIBERSORT和單樣本基因集富集分析(ssGSEA)方法進行免疫浸潤分析。最后，構(gòu)建了一個包含F(xiàn)EPM評分和TNM分期的nomogram用于預(yù)測預(yù)后。

主要研究結(jié)果

1.?篩選關(guān)鍵的ERGs和FRGs用于構(gòu)建預(yù)后模型

將1208個ERGs和FRGs，與TCGA數(shù)據(jù)分析出的差異表達(dá)基因(DEGs)取交集，獲得336個基因 (圖1A, B)。單變量Cox回歸分析確定了38個預(yù)后相關(guān)基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)顯示FRGs和ERGs之間的相互作用(圖1C)。LASSO Cox回歸分析確定了鐵死亡和EMT相關(guān)預(yù)后模型(FEPM)的13個關(guān)鍵基因(圖1D, E)。13個基因的表達(dá)如熱圖所示(圖F)，其中有9個ERGs，3個FRGs， 1個基因(SQSTM1)同時屬于ERGs和FRGs。

圖1.篩選預(yù)后模型的關(guān)鍵基因

2.?計算風(fēng)險評分

以中位風(fēng)險評分為臨界值(圖2A)，將TCGA隊列分為高FEPM組和低FEPM組。Kaplan-Meier曲線顯示，高FEPM組患者的總生存期明顯較短(圖2C)。風(fēng)險評分較高的患者死亡較早，生存時間較短(圖2B)。根據(jù)時間相關(guān)的ROC曲線，1年曲線下面積(AUC)為0.820,3年為0.753,5年為0.737(圖2D)。

圖2.TCGA隊列中FEPM的生存分析

3.?ICGC隊列驗證預(yù)后模型

根據(jù)TCGA隊列的相同計算方法計算風(fēng)險評分，將ICGC隊列分為高FEPM組和低FEPM組，得到類似的結(jié)果。

4.?FEPM評分是一個獨立的預(yù)后因素

熱圖顯示這13個關(guān)鍵基因在TCGA隊列的兩個亞組中表達(dá)水平不同(圖4A)。

將FEPM評分和臨床病理特征作為預(yù)測因素進行單變量Cox回歸分析。森林圖顯示，無論是在TCGA隊列或ICGC隊列中，F(xiàn)EPM評分都是HCC患者預(yù)后的重要危險因素 (圖4B, D)。將具有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)測因素進行多變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)FEPM評分是HCC患者的獨立預(yù)后因素 (圖4C, E)。

圖4.熱圖、單因素和多因素Cox回歸分析

5.?鐵死亡及EMT狀態(tài)分析

為了分析鐵死亡的狀態(tài)，作者對比了兩個亞組中16個鐵死亡抑制因子(SOFs)的表達(dá)譜。在TCGA隊列中，高FEPM組中所有這些SOFs的表達(dá)均顯著上調(diào)(圖5A)。在ICGC隊列的高FEPM組中，大多數(shù)SOFs的表達(dá)水平也較高(圖5B)。說明高fepm組似乎具有抑制性鐵死亡的狀態(tài)。在TCGA隊列中進行GSEA，發(fā)現(xiàn)在低FEPM組中，許多與鐵死亡相關(guān)的代謝途徑顯著增強(圖5E)。

為了分析EMT狀態(tài)，作者比較了14個上皮標(biāo)記物、間充質(zhì)標(biāo)記物和EMT轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TF）在不同組間的表達(dá)。在TCGA隊列中，高FEPM組間充質(zhì)標(biāo)志物和EMT-TF的表達(dá)顯著增加(圖5C)。在ICGC隊列中，高FEPM組間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)也顯著升高(圖5D)。說明高FEPM組有更積極的EMT狀態(tài)。

6.?腫瘤免疫微環(huán)境分析

利用ssGSEA計算TCGA隊列中免疫細(xì)胞的富集評分，通過聚類分析的方法確定了高免疫浸潤聚類和低免疫浸潤聚類兩個亞型(圖6A)。CIBERSORT分析顯示，高FEPM組Tregs等浸潤水平較高。

圖6. 腫瘤免疫微環(huán)境分析

ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)等免疫抑制細(xì)胞顯著上調(diào)(圖7A, B)。此外，免疫檢查點分子在高FEPM組高表達(dá)(圖7C-J)。

圖7. (A, B) ssGSEA富集評分；(C-J)免疫檢查點分子的表達(dá)

7.?構(gòu)建nomogram并評估其預(yù)測效果

Nomogram納入兩個獨立的預(yù)后因素，包括FEPM評分和TNM分期(圖8A)。時間相關(guān)的ROC曲線表明了其良好的敏感性和特異性。

圖8.Nomogram和ROC曲線

校準(zhǔn)曲線進一步顯示，nomogram預(yù)測值與實際值高度一致。決策曲線分析(DCA)顯示nomogram可在較寬的閾值范圍內(nèi)提供臨床獲益。

圖9.校準(zhǔn)曲線和決策曲線分析

總結(jié)

這篇文章的亮點就是基于鐵死亡和EMT進行了雙熱點的生信分析，之后的預(yù)后模型、構(gòu)建風(fēng)險評分、分析不同風(fēng)險組患者腫瘤微環(huán)境、構(gòu)建nomogram等均為常規(guī)分析。常規(guī)思路的純生信也能輕松發(fā)表8分+，性價比超高！

除了雙熱點的分析思路，還可以借鑒作者分析鐵死亡狀態(tài)和EMT狀態(tài)的方法~。

如果你還苦惱于生信分析沒有思路，或者嫌分析方法太過簡單、太過老套，想要創(chuàng)新思路的，或者對EMT、鐵死亡等熱點方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧！