蛋白純化的標準化流程

蛋白分離純化方法的選擇-鎳柱親和純化

1.?鎳柱的選擇（公司）

2.?預(yù)裝柱與否（公司）

3.?AKTA蛋白純化儀器的使用（儀器的操作）

蛋白純化的5個步驟

1、純化上樣前樣品的準備

（破碎緩沖液，破碎時候進行降溫；蛋白酶抑制劑防止蛋白降解；細胞裂解液）

2、配制緩沖液（平衡-上樣-洗雜-洗脫）

3、脫鹽

4、濃縮

5、濃縮管濃縮

測定蛋白的濃度（方法的選擇）

1)?BSA試劑盒濃度測定

2)?BSA蛋白標準測定（使用BSA設(shè)置1ug/1.5ug/2ug/2.5ug/3ug/4ug/6ug/8ug這幾個蛋白質(zhì)量梯度）

3)?簡單化的儀器測定

蛋白性狀的鑒定

1.?分子峰圖

2.?非變性膠

3.?電鏡

4.?DLS

5.?電勢

蛋白分離純化方法-鎳柱純化

1．蛋白溶液與beads-Ni孵育，4℃ 2h，1ml beads 可以承載10mg蛋白；

2．轉(zhuǎn)移混合液至柱中；

3．低濃度咪唑溶液洗掉雜蛋白，根據(jù)文獻或者經(jīng)驗確定濃度（25mM），重力作用，洗10ml；

4．高濃度咪唑溶液收集目的蛋白溶液；根據(jù)文獻或者經(jīng)驗確定濃度（250mM）,2ml/tube收集至考馬斯亮藍染色法無明顯變藍為止；

5．完成后，清洗柱子，最后用20%的乙醇進行保存。

蛋白的濃縮

將收集的流穿液使用濃縮管進行濃縮，可以達到富集和換液的作用。

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His標簽蛋白純化產(chǎn)品選擇

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?鎳柱純化蛋白常見問題匯總

1、his標簽純化后，雜帶比較多，純度不夠。

原因

解決方案

蛋白的降解條帶

在純化過程中加入足量的蛋白酶抑制劑

非特異結(jié)合柱子的雜蛋白

調(diào)整結(jié)合液的咪唑濃度

雜蛋白與目的蛋白結(jié)合

超聲前加入去垢劑

2、在純化過程中，蛋白出現(xiàn)混濁。

原因

解決方案

蛋白在環(huán)境中不穩(wěn)定或蛋白自身不穩(wěn)定

檢查所用緩沖液是否合適，環(huán)境溫度是否合適，在緩沖液中加入還原劑（DTT）

3、純化結(jié)束后，沒收獲his標簽蛋白，目的蛋白流穿

原因

解決方案

超聲功率，破胞條件不充分

調(diào)整破胞條件

樣本和結(jié)合液未結(jié)合

檢查緩沖液成分，PH等

樣本和填料結(jié)合不充分

降低流速，延長孵育的時間

組氨酸暴露不完全

改變標簽位置，適當增加組氨酸個數(shù)

蛋白與金屬離子不結(jié)合

更換所用例離子的類型

4、蛋白洗脫不完全

原因

解決方案

洗脫條件溫和

適當增加咪唑濃度或降低PH

蛋白已經(jīng)沉淀在柱子上

選用耐受還原劑的填料，在洗脫液中加入適量DTT，改變緩沖液鹽濃度

蛋白有其他相互作用，如非特異性疏水性等

在洗脫液中加入非離子型離子去垢劑，增加氯化鈉濃度

5、鎳柱使用過程中出現(xiàn)棕色

原因

解決方案

緩沖液中有還原劑，如DTT

緩沖液不加DTT或者降低DTT濃度

通常來說DTT對鎳柱的顏色和性能有顯著影響，一般在使用鎳柱時盡量避免溶液中含有DTT。而Cytiva對其Ni Sepharose 6 Fast Flow的填料進行了耐受測試，DTT高達5mM時不會影響Ni Sepharose 6 Fast Flow的結(jié)合量或者鎳離子脫落。雖然在3mM DTT上柱時填料顏色會發(fā)生明顯變化，但沒有影響填料的性能。

鎳柱的日常使用tips

1對于多數(shù)的預(yù)裝鎳柱，上樣前，樣品需要使用0.22um/0.45um濾膜進行過濾或者離心處理，以避免樣品中有細胞碎片等固體物質(zhì)，堵塞柱子。

2、細胞裂解后非常粘稠，有可能是因為DNA、RNA這類核酸物質(zhì)過多，需要加入核酸酶去除，以降低樣品粘稠度，提高上樣速度及洗脫效果。

3、柱子在使用過程中，不能超過填料的耐受壓力，以免填料被壓塌。

4、每次使用結(jié)束后，可用5-10倍柱體積的純水或者結(jié)合緩沖液對柱子進行清洗。（如果出現(xiàn)載量嚴重下降或者壓力增加，需要考慮對柱子徹底清洗）。

蛋白純化-靜態(tài)孵育

通過上下顛倒混合，或者搖床搖動，使得純化介質(zhì)和樣品充分混勻，達到用介質(zhì)吸附目的蛋白的目的。

蛋白純化-重力法

依靠重力使得樣品流經(jīng)純化介質(zhì)，在樣品和介質(zhì)接觸過程中，目的蛋白與純化介質(zhì)結(jié)合。

免疫親和沉淀

用帶有預(yù)先固定抗體的介質(zhì)，捕獲細胞裂解上清中的目的蛋白，用于研究目的蛋白間相互作用或者目的蛋白的活性研究。

純化得到的組分中沒有或者很少目的his標簽蛋白，怎么回事？

A：若目的his標簽蛋白正常表達（使用his標簽的抗體進行WB檢測），且充分釋放上清中，確認蛋白是流穿還是未被洗脫；

若his標簽蛋白流穿：

樣品或結(jié)合緩沖液的條件不合適，注意螯合劑或強還原劑以及咪唑的濃度。

His標簽蛋白與填料的結(jié)合較弱；降低上樣流速或者增加孵育時間；增加his的數(shù)量（常用6-10個）

標簽未充分暴露，在變性條件下（4-8M尿素或者4-6M鹽酸胍）下進行純化或測試；重新構(gòu)建克隆，改變His標簽位置。

嘗試其他的金屬離子結(jié)合力：如ZN2+CU2+CO2+等。

若his標簽蛋白未洗脫：

洗脫條件過于溫和：

增加咪唑濃度或者降低洗脫PH（注意PH在4以下時候NI2+會發(fā)生脫落）

目的蛋白與填料發(fā)生非特異性疏水或其他相互作用；

在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（如2%Triton X-100）或提高NaCl濃度。

目的蛋白雜填料中發(fā)生了沉淀；

減少上樣量；使用咪唑線性梯度洗脫以降低洗脫得到的蛋白濃度；使用去垢劑或改變NaCl濃度；

在變性條件下（4-8M尿素或者4-6M鹽酸胍）下洗脫。

His標簽蛋白純化試驗中，常用的緩沖液成分是什么？

建議緩沖溶液成分如下

結(jié)合緩沖溶液：

20mM Tris-Hcl,250mM Nacl（避免非特異性吸附），10mM咪唑（提高濃度可以增加純度但是會降低效率），ph 8.0 可以根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)PH。

洗脫緩沖溶液

20mM Tris-Hcl，10mM咪唑，250mM NaCl ph 8.0。

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洗脫得到得到的His標簽蛋白樣品雜帶較多，但是純度不高，應(yīng)該如何改進？

可以考慮從以下原因與解決方法

??原因：His標簽打那筆被部分降解：

添加蛋白酶抑制劑（慎用EDTA）；保持蛋白樣品在低溫 下操作；縮短呢實驗操作時間。

雜蛋白對于金屬粒子也有較強的結(jié)合

優(yōu)化結(jié)合，洗脫條件（咪唑濃度、Nacl濃度、ph條件等）；

嘗試不同金屬離子螯合的填料

增加后續(xù)的純化步驟，例如離子交換、凝膠過濾 等；

構(gòu)建雙標簽?zāi)康牡鞍走M一步純化。

??雜質(zhì)與目的蛋白存在相互作用而共洗脫

在細胞破碎前加入去垢劑或者還原劑

提高wash buffer中去垢劑濃度（2% Triton X-100或者2% Tween 20）或者添加甘油（20%以內(nèi)）以破壞非特異性相互作用；

將緩沖液的鹽濃度提高到500mM Nacl.

??洗雜步驟不夠充分

重復(fù)洗雜的步驟使得洗雜充分

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??普通鎳柱是否可以在不脫鎳的情況下進行清洗？

如果條件溫和，可以不脫鎳。

去除沉淀或者變性物質(zhì)，可以嘗試用2倍柱體積的6M鹽酸胍或者8M尿素洗滌，然后用5倍柱子體積的緩沖液洗滌。

除去疏水結(jié)合的物質(zhì)，可以唱2倍柱子體積1%的Triton X -100洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌。

??鎳柱在使用過程中出現(xiàn)了棕色怎么回事？

主要是緩沖液中的DTT的影響，在堿性的緩沖條件下，鎳離子會被DTT還原成棕色的沉淀。如果樣品或者緩沖液中含有DTT，在上樣之前，建議采用不含還原性試劑的空白運行來任何較弱結(jié)合的鎳離子；當不使用時候，勿將Ni填料含于含還原性試劑的緩沖液中?？瞻走\行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）

1.?5倍柱體積的雙蒸水清洗柱子

2.?5倍柱體積的洗脫液洗柱。

3.?10倍柱體積的平衡液平衡。

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??普通的鎳填料是否可以重復(fù)使用？可以使用多少次？

如果維護好的話，填料在有效期內(nèi)可以一直使用。

如果每次都是純化相同的蛋白，沒必要剝離鎳離子重新掛鎳離子，一般經(jīng)過3-5次純化后可以進行脫鎳和再生鎳操作。

如果對于實驗要求比較高，可以每做一次試驗后對填料再生一次。

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??鎳柱子堵住了怎么辦？

柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中的細胞碎片或者其他雜質(zhì)顆粒所致，所以樣品一定要離心，或者用0.22/0.45的濾膜過濾。

由于大腸桿菌比較難以過濾，如果只用10000g的轉(zhuǎn)速離心后直接上柱子，對于填料的損傷比較大，很容易堵塞柱子（建議40000-50000/30min），如果沒有那么大的離心的離心機可以延長離心時間（12000轉(zhuǎn)/20000g）60min

柱子經(jīng)常發(fā)生堵塞會報廢（這個時候需要對柱子進行重裝）

若果柱子發(fā)生堵塞，請及時在位清洗，不成功的話，這可能是篩板堵塞需要更換篩板或者柱子，并在下次上樣時候優(yōu)化的樣品處理方法。對于預(yù)裝柱或者填料，請做好日常的清洗和維護，具體操作方法可以參考說明書。

若柱子出現(xiàn)反壓增高了，請進行徹底的在位清洗CIP。

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?Ni-IDA:三齒配位，三個位點結(jié)合組氨酸，結(jié)合標簽?zāi)芰ψ顝?，但是鎳離子相對容易脫落，產(chǎn)生非特異吸附，嚴格按照要求配置緩沖液成分。結(jié)合標簽?zāi)芰ψ顝姡慌浠鄬θ菀酌撀?，產(chǎn)生一些非特異性吸附，嚴格按照配制緩沖液成分。

NI-NTA：四齒配位，留下兩個位點與組氨酸配位

Ni-TED:五齒配位，只留下一個位點與組氨酸配位，因此結(jié)合his標簽?zāi)芰︼@著低于其他的兩種;鎳離子不容易脫落；結(jié)合his能力顯著降低；

目前最常用的Ni填料：Ni-IDA和Ni-NTA

使用填料之前，細讀產(chǎn)品說明書

主要從化學(xué)穩(wěn)定性、試劑兼容性、平衡液、洗脫液配方等等，進行詳細閱讀。

避免重組蛋白交叉污染，使用新的填料，洗脫鎳后再掛金屬離子。平衡前可以用高濃度咪唑清理柱體。一般2-3個CV。

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柱體積CV計算方法：πr2*h，可以利用πr方乘以柱高來計算。

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使用幾次后發(fā)現(xiàn)鎳柱的載量下降或者掛柱效率降低，可能是由于逐漸積累的沉淀、變性或非特異性結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點，而通過洗脫方法無法徹底清洗所致。建議采用不同的清洗方法來提高載量。

由于NaOH的清潔效果最好，一般按說明書中的操作方先脫鎳在進行清潔。

一、脫鎳

二、用5-10倍柱子體積的脫鎳緩沖液，如50mMPB,500mM NaCl.200mM EDTA ph 7.0)進行脫鎳操作。

三、沖洗：用5-10倍柱體積的平衡 （清除EDTA），最后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗。

四、清洗

清洗操作

一般試驗使用洗脫緩沖液沖洗即可

去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體積的1.5M Nacl溶液，然后按照10倍柱體積的雙蒸水沖洗。

去除沉淀或者變性蛋白，可以使用1M氫氧化鈉溶液，接觸1-2小時，然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水進行沖洗。

去除疏水性蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗，然后10倍 柱體積的雙蒸水洗滌。

各類Buffer:

溶液過酸或者過于堿性的話會造成填料上的鎳離子的脫落

后期可以調(diào)節(jié)的是PH和咪唑濃度

一般先確定咪唑的范圍濃度

結(jié)合buffer:20mMTris ,0.3M Nacl,5-20mM咪唑，ph7.4；

平衡柱子，緩沖液和鹽濃度及ph最好和樣本一致。

洗脫buffer:20mM Tris,0.3M Nacl,50-500mM咪唑，ph 7.4，純化為之蛋白可以設(shè)置梯度。

Buffer洗脫

a.?Wash buffer 洗10CV，用離心管接收流出液寫好標簽wash：（Wash buffer:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl）

b.?5mM咪唑，洗10CV，用離心管接收流出液寫好標簽5mM：（5mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，5mM咪唑）

c.?10mM咪唑，洗10CV，用離心管接收流出液寫好標簽10mM：（10mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，10mM咪唑）

d.?20mM咪唑，洗10CV，用離心管接收流出液寫好標簽20mM：（20mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，20mM咪唑）

e.?50mM咪唑，洗10CV，用離心管接收流出液寫好標簽20mM：（50mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，50mM咪唑）

f.?300mM咪唑，洗10CV，用離心管接收流出液寫好，標簽300mM：（300mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，300mM咪唑,300mM 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10

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