2023年2月，浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院祝水金團(tuán)隊(duì)在Molecular Plant雜志（IF=21.949）發(fā)表題為“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in ”的研究論文，該研究對(duì)色素腺體形態(tài)發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程以及調(diào)控色素腺體性狀的分子機(jī)制進(jìn)行了深入探索。趙天倫特聘副研究員和祝水金教授為該論文通訊作者，博士生孫悅和韓一飛為共同第一作者。

研究背景

棉花（. spp）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉籽中含有豐富的油分及蛋白質(zhì)。色素腺體是棉屬特有的防御結(jié)構(gòu)，其主要內(nèi)含物棉酚在棉花病蟲(chóng)害抗性中起重要作用，但因其對(duì)人類和反芻動(dòng)物的毒性，限制了棉籽資源的利用。比克氏棉（）等澳洲野生棉種具有優(yōu)良的“子葉色素腺體延緩形成形狀”性狀，種子無(wú)色素腺體低棉酚，有利于充分利用棉籽資源；植株有色素腺體有棉酚，有助于保持植株對(duì)病蟲(chóng)害的抗性，具有重要的育種價(jià)值。探究色素腺體形態(tài)發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程及其潛在分子機(jī)制，對(duì)培育種子無(wú)色素腺體而植株有色素腺體的新型低酚栽培棉種至關(guān)重要。

研究?jī)?nèi)容

本研究利用萌發(fā)48小時(shí) 子葉（色素腺體形態(tài)發(fā)生的活躍階段）作為樣本制備原生質(zhì)體，進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。進(jìn)而采用無(wú)監(jiān)督聚類將細(xì)胞分成14個(gè)類群，通過(guò)已知細(xì)胞marker基因分為8個(gè)細(xì)胞類型。聚類結(jié)果證實(shí)色素腺體細(xì)胞與其他細(xì)胞分離明顯，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞亞群分為色素腺體薄壁細(xì)胞、分泌細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。結(jié)合單細(xì)胞表達(dá)圖譜信息，并整合色素腺體細(xì)胞發(fā)育軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、核心轉(zhuǎn)錄因子功能驗(yàn)證，構(gòu)建出相對(duì)完整的色素腺體形態(tài)建成模型，并證實(shí)光和赤霉素可促進(jìn)色素腺體的形成。此外，本文挖掘了3個(gè)影響色素腺體形成的基因和。這些發(fā)現(xiàn)揭示了棉花色素腺體形態(tài)發(fā)生生物學(xué)過(guò)程以及調(diào)控色素腺體性狀的分子機(jī)制。

研究路線

研究結(jié)果

1.棉花子葉單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建

生理發(fā)育試驗(yàn)研究證實(shí)，比克氏棉休眠棉籽無(wú)色素腺體無(wú)棉酚，直到種子萌發(fā)12小時(shí)后才檢測(cè)到棉酚，并在萌發(fā)過(guò)程中逐漸在子葉中積累。因此為了利用scRNA-seq構(gòu)建完整的色素腺體發(fā)育軌跡，本研究選取萌發(fā)48小時(shí)的比克氏棉子葉樣本。采用scRNA-seq平臺(tái)對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，成功獲得12222個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。進(jìn)一步通過(guò)主成分分析(PCA)和無(wú)監(jiān)督聚類，分離14個(gè)不同的細(xì)胞類群。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道細(xì)胞類型marker鑒定，將14個(gè)不同的cluster分為8個(gè)細(xì)胞群，包括葉肉細(xì)胞(MC)、色素腺體細(xì)胞(PG)、表皮細(xì)胞(EC)、保衛(wèi)細(xì)胞(GC)、木質(zhì)部細(xì)胞(XC)、原形成層細(xì)胞(PC)、韌皮部薄壁細(xì)胞(PP)和伴細(xì)胞(CC)。

為了驗(yàn)證新的細(xì)胞標(biāo)記基因，本文通過(guò)RNA原位雜交確定了兩個(gè)新細(xì)胞標(biāo)記基因： 和，進(jìn)一步明確了色素腺體細(xì)胞類群定義的可靠性。此外，從bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中獲得的表達(dá)模式也支持scRNA-seq特異性色素腺體細(xì)胞的結(jié)論，功能分析證實(shí)較多富集通路與感興趣的細(xì)胞相關(guān)。

圖1 |?棉花子葉單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建

2.色素腺體細(xì)胞的發(fā)育軌跡

色素腺體細(xì)胞類型與其他細(xì)胞類型分離明顯，進(jìn)一步將其分為三個(gè)細(xì)胞亞群，棉酚生物合成基因在亞型2中高度富集，表明亞型2為分泌細(xì)胞，亞型1被確定為色素腺體薄壁細(xì)胞，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞亞型進(jìn)行GO分析，證實(shí)核糖翻譯相關(guān)的功能在色素腺體薄壁細(xì)胞中富集，與萜類化合物生物合成相關(guān)在分泌細(xì)胞中富集。由于氧化還原酶活性的富集，線粒體和核糖體基因的低表達(dá)，推測(cè)亞型3是凋亡前細(xì)胞。bulk RNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)了細(xì)胞亞型的分配。

為了揭示參與色素腺體發(fā)育時(shí)空調(diào)控的基因，通過(guò)擬時(shí)序分析進(jìn)行模塊劃分。模塊a涉及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)，表明色素腺體細(xì)胞發(fā)育的激活可能依賴于外部刺激。模塊d顯示出萜類生物合成的特征，與成熟分泌細(xì)胞中的棉酚合成一致。模塊e涉及DNA構(gòu)象變化等，是凋亡細(xì)胞的典型特征。

圖2 |?色素腺體細(xì)胞的發(fā)育軌跡

3.參與色素腺體形成轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

與色素腺體分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在色素腺體細(xì)胞中被鑒定出來(lái)，包括和。從薄壁細(xì)胞到分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變受和的調(diào)控，而從分泌細(xì)胞到凋亡細(xì)胞的轉(zhuǎn)變受的調(diào)控。為了尋找下游基因，對(duì)進(jìn)行DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)，將DAP-seq和scRNA-seq進(jìn)行整合，建立了一個(gè)以為樞紐基因的TF網(wǎng)絡(luò)，獲得棉花色素腺體形態(tài)建成的工作模型。

為了驗(yàn)證該模型，進(jìn)而對(duì)子葉采用bulk RNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量在萌發(fā)過(guò)程中增加。采用病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)方法驗(yàn)證8個(gè)代表性轉(zhuǎn)錄因子的功能，證實(shí)沉默的幼苗葉和莖中的色素腺體密度和棉酚含量均顯著低于陰性對(duì)照的幼苗。結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)錄因子可能在棉花色素腺體的形成中起重要作用。

圖3 | 棉花色素腺體形態(tài)建成模式圖

圖4 |?轉(zhuǎn)錄因子在色素腺體發(fā)育中的功能驗(yàn)證

4.光和GA參與色素腺體的形成

此外，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)表型分析，結(jié)合核心轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子鑒定，發(fā)現(xiàn)了光和赤霉素影響棉花色素腺體形成，并通過(guò)暗、光、赤霉素(GA)和赤霉素抑制劑（多效唑）不同組合處理下的比克氏棉色素腺體的發(fā)育情況進(jìn)行驗(yàn)證。在種子吸收36、48、60、84 h，光照+GA條件的色素腺體密度大于光照條件，顯著大于暗+GA條件的色素腺體密度。結(jié)果表明，光和GA能夠促進(jìn)色素腺體的形成。進(jìn)一步比較暗處理和光處理下色素腺體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，在無(wú)光條件下表達(dá)水平下調(diào)。此外，在黑暗條件下，大多數(shù)棉酚生物合成基因的表達(dá)水平上調(diào)，這表明光可能抑制棉酚的合成。

圖5 |?光和GA促進(jìn)色素腺體發(fā)育

研究結(jié)論

本文描繪了首個(gè)棉花子葉單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，利用比克氏棉色素腺體的獨(dú)特性狀和scRNA-seq技術(shù)揭示了色素腺體的發(fā)育軌跡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)3個(gè)影響色素腺體形成的新基因和。這些發(fā)現(xiàn)為色素腺體的形態(tài)發(fā)生提供新見(jiàn)解，并為未來(lái)的棉花scRNA-seq研究奠定基礎(chǔ)。

推薦語(yǔ)

本文探索了棉花色素腺體發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程以及調(diào)控形態(tài)發(fā)生性狀的分子機(jī)制，首先構(gòu)建棉花子葉單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，其次利用色素腺體細(xì)胞發(fā)育軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、核心轉(zhuǎn)錄因子功能驗(yàn)證等方法，揭示了一個(gè)相對(duì)完整的色素腺體形態(tài)建成模型。這篇文章系統(tǒng)闡述了棉花色素腺體形態(tài)和生物學(xué)過(guò)程的重要作用機(jī)制，并突出單細(xì)胞RNA測(cè)序及其擬時(shí)序分析的研究?jī)r(jià)值，十分值得借鑒。

Sun Y, Han YF, Sheng K,.?Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in[J]. , 2023.