一、慢病毒

??1）概念

慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)、球形。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細(xì)胞的類型)，再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶)。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個(gè)屬，其主要有8種能夠感染人和脊椎動(dòng)物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，最終導(dǎo)致感染個(gè)體發(fā)病。慢病毒的基因組都很復(fù)雜，編碼一系列不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控蛋白，這使得它們具有獨(dú)特的調(diào)控途徑和病毒持久性機(jī)制。

2）慢病毒感染的顯著特點(diǎn)

感染個(gè)體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此這些病原體被稱為慢病毒。慢病毒包裝系統(tǒng)一般由慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝載體組成。而慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的慢病毒載體所需要的所有輔助蛋白。

3）慢病毒感染效率受到多種因素的影響

①考慮病毒包裝制備是否存在問(wèn)題，比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等。

②考慮病毒運(yùn)輸和保存方式是否得當(dāng)，解凍病毒一定要在冰上進(jìn)行，避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響病毒滴度；-80℃保存半年以上需要重新測(cè)定滴度。

③細(xì)胞狀態(tài)對(duì)于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也具有很大的影響，良好的生長(zhǎng)狀態(tài)是達(dá)到高感染效率的保證，一般選擇細(xì)胞形態(tài)較好、輪廓清晰、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行感染可提高感染效率。

4）臨床慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)用途關(guān)于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的臨床實(shí)驗(yàn)。

　　基因治療的臨床效果取決于細(xì)胞的高水平轉(zhuǎn)導(dǎo),雖可通過(guò)二次轉(zhuǎn)導(dǎo)或提高感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)增加轉(zhuǎn)導(dǎo)率,但延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間可誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期而影響其分化增殖能力;提高gan ran復(fù)數(shù)會(huì)提高插入突變風(fēng)險(xiǎn)和增加生產(chǎn)成本。因此,在不斷改造慢病毒以增加安全性的同時(shí),提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是亟待解決的難題。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的限制因素包括病毒黏附、入胞、細(xì)胞運(yùn)輸及固有免疫作用。通過(guò)引入異源病毒包膜構(gòu)建新的偽型載體和或在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中添加病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑(transductionenhancers,TEs),可有效克服LVVs轉(zhuǎn)導(dǎo)的障礙,增加轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞比例,從而達(dá)到臨床需要的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。

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二、慢病毒載體

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1）概念

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒可將外源基因整合到基因組中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，具有感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的特性。

慢病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂

2）慢病毒載體特性

慢病毒載體具有宿主范圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長(zhǎng)期表達(dá)等特點(diǎn)。能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，達(dá)到持久性表達(dá)，因而可構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，用于基因的細(xì)胞功能研究。借助慢病毒載體改造T細(xì)胞可用于CAR-T細(xì)胞治療。

3）慢病毒包裝與純化

　　慢病毒包裝采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行包裝，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)超速離心濃縮純化和收集病毒。

慢病毒滴度檢測(cè)

檢測(cè)方法：定量PCR檢測(cè)感染后細(xì)胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理：慢病毒介導(dǎo)外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進(jìn)目的細(xì)胞基因組

4）慢病毒載體優(yōu)勢(shì)

①?表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)：慢病毒可將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組上，實(shí)現(xiàn)基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的表達(dá)，不隨細(xì)胞分裂傳代而丟失，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的首選，常用于構(gòu)建穩(wěn)定株。
② 安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細(xì)胞用于CAR-T細(xì)胞治療。
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

5）常規(guī)應(yīng)用

體外感染細(xì)胞

　　慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型原代細(xì)胞和大部分細(xì)胞系。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，因而可以達(dá)到持久性表達(dá)，從而構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，體外進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等研究。穩(wěn)定表達(dá)目的基因的腫瘤細(xì)胞株還可以進(jìn)一步構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行體內(nèi)基因功能驗(yàn)證，藥效藥代，活體成像等檢測(cè)，進(jìn)一步研究體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移及藥物治療的效果。