目 錄

基礎(chǔ)信息

內(nèi)容概述

陰莖海綿體（CC）是陰莖勃起最重要的結(jié)構(gòu)，其功能障礙（ED）引起患者及其家庭的許多生理、心理問題。然而，由于倫理、輿論等方面的禁忌，以及獲取樣本的途徑有限，對陰莖海綿體的細胞異質(zhì)性和分子水平的細胞通訊網(wǎng)絡(luò)研究甚少。本研究作者通過分析來自3名勃起正常的男性和5名器質(zhì)性勃起功能障礙患者（其中包括2名糖尿病性勃起功能障礙(DMED)患者）的64993個人陰莖海綿體單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時結(jié)合RNAs-seq，qPCR以及免疫組化染色等細胞功能學(xué)實驗，揭示了人類陰莖海綿體的單細胞圖譜和細胞異質(zhì)性，闡述了人類陰莖海綿體組織的細胞微環(huán)境，為潛在的勃起功能障礙治療提供了理論參考。

研究思路

本研究仍然是經(jīng)典的“總-分”結(jié)構(gòu)：先總體概況項目實驗方案、細胞組成、特征基因等內(nèi)容，再逐步轉(zhuǎn)入到針對各個研究對象的精細亞群分析和功能驗證。再加上本研究將單細胞數(shù)據(jù)分析與細胞功能實驗有機結(jié)合起來，進一步增強了單細胞分析結(jié)論的可信度及其臨床生物學(xué)意義，可以稱得上一篇結(jié)構(gòu)工整，細節(jié)處處體現(xiàn)新意的單細胞文章范本，非常值得大家參考與借鑒。

研究內(nèi)容一：項目數(shù)據(jù)概況

圖1a采用卡通流程圖的形式總結(jié)了項目的整體實驗方案設(shè)計，圖1b以聚類圖的形式展示了64993個單細胞數(shù)據(jù)的細胞組成和樣本來源。隨后作者分別以特征圖（圖1c）和熱圖及GO注釋（圖1d）的方式，展示了陰莖海綿體樣本中，各個細胞類型的特征基因及其相關(guān)的生物學(xué)過程。經(jīng)過卡通流程圖+聚類圖+特征圖+熱圖的經(jīng)典組合，作者分層次有條理地向大家描繪了人的陰莖海綿體樣本的單細胞數(shù)據(jù)概況。

編者心得一：分析對象的選擇原則

如前所述，在圖1中已經(jīng)對陰莖海綿體樣本中的細胞組成比例，樣本來源以及特征基因表達，有了初步的認識。總體概況做好了，那接下來的關(guān)鍵問題就是：我該選擇哪種細胞類型作為研究對象，進行細致的分析和研究？有的讀者當然會說，小孩子才做選擇，成年人當然是我全都要！

其實即使是數(shù)據(jù)中的每一種細胞類型都要做細致的分析，在開展分析和結(jié)果展示的時候，也是有先有后、詳略得當?shù)摹Ｏ旅鏋榇蠹曳钌暇幷邍I血總結(jié)出來的黃金原則：

???原則1：基于研究興趣/研究領(lǐng)域，選擇主觀上最感興趣的細胞類型

過去研究者一直認為陰莖海綿體僅僅屬于一種特化的血管結(jié)構(gòu)，但陰莖海綿體中的血管內(nèi)皮細胞（EC）的具體分類及其特征基因表達、內(nèi)皮細胞與其他細胞的互作、內(nèi)皮細胞發(fā)生了哪些改變導(dǎo)致了ED患者的表型等等這些問題，并沒有得到深入而細致地研究。并且在這套數(shù)據(jù)的所有的細胞之中，有接近40%的細胞是血管內(nèi)皮細胞。因此根據(jù)作者的研究背景，主觀上最感興趣的細胞類型當然要屬血管內(nèi)皮細胞（EC）。隨后作者也在用了圖5和圖6兩張圖的篇幅，來集中討論血管內(nèi)皮細胞（EC）表型與功能。

???原則2：基于客觀分析的細胞組成：選擇細胞數(shù)變化最顯著的細胞類型

除了根據(jù)主觀興趣之外，還可以根據(jù)數(shù)據(jù)分析的客觀結(jié)果，選擇分析對象。例如根據(jù)圖1b的結(jié)果，來自 ED患者的樣品中的平滑肌細胞（SMC）數(shù)目顯著高于來自正常人樣本的SMC細胞數(shù)。同時考慮到平滑肌細胞的收縮與舒張，可以通過控制陰莖的血流量進而而影響勃起狀態(tài)。綜合考慮以上信息，平滑肌細胞（SMC）的數(shù)目變化及其細胞生物學(xué)功能可能與ED患者臨床表型的發(fā)生和進展有比較強的相關(guān)性。隨后作者也在圖4中研究了平滑肌細胞（SMC）的精細亞群及其特征表達基因，以及與平滑肌收縮/舒張的關(guān)鍵基因與信號通路。

???原則3：基于客觀分析的基因表達：選擇細胞通訊最頻繁的細胞類型

除了定量比較不同組別間的細胞數(shù)目多少，還可以在基因表達的分子生物學(xué)層面去尋找值得深入研究的目的細胞類型。例如作者別出心裁地利用圖1e，展示了陰莖海綿體組織的細胞通訊網(wǎng)絡(luò)中，各種細胞類型發(fā)出/接收信號的頻度?？梢钥闯龀衫w維細胞（FB）具有最強的發(fā)出信號，同時又幾乎沒有接收信號，因此推測成纖維細胞（FB）在整個細胞通訊網(wǎng)絡(luò)中，處于的發(fā)號施令的核心狀態(tài)。因此作者認為，深入研究成纖維細胞（FB）的精細亞群及其在細胞通訊過程中的生物學(xué)功能，極有可能有助于解析ED患者的臨床發(fā)病機制。隨后作者也利用圖2和圖3，詳細闡述了成纖維細胞（FB）的精細亞群及其特征基因，以及成纖維細胞（FB）參與的細胞通訊網(wǎng)絡(luò)。圖1e，雖然只占據(jù)了左下角非常小的篇幅，卻很好的起到了承前啟后的作用，將項目總括的圖1與隨后精細亞群分析內(nèi)容自然地串聯(lián)起來。這種通過細胞通訊最頻繁的依據(jù)來選擇分析對象的方式比較有新意，非常值得讀者參考。

研究內(nèi)容二：細胞通訊網(wǎng)絡(luò)的分析與驗證

前文提到細胞通訊網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果顯示成纖維細胞（FB）顯示最強大的信號輸出能力，表明FBs是調(diào)控微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。出乎意料的是，MAC、SWC和T集群表現(xiàn)出典型的信號接收模式。在這些信號相互作用中，作者發(fā)現(xiàn)了許多經(jīng)典的血管組織調(diào)節(jié)途徑，如VEGF、IGF、NOTCH等。并進一步鑒定了KIT(SCF受體)、FGF、EGF等正常與ED病理狀態(tài)下表現(xiàn)出差異表達模式的信號。為了進一步驗證細胞通訊的分析結(jié)果，作者還設(shè)計了RNA-seq、ICC和ELISA等一系列實驗。。如補充圖3a與3c分別展示了FB的RNA-seq和ICC結(jié)果，證明CellChat預(yù)測的大多數(shù)配體（TGFβ、CXCL12、FGFs、）在體外均在FB中表達。與此同時，補充圖3b展示了內(nèi)皮細胞（EC）的RNA-seq結(jié)果，證明了與之對應(yīng)的受體蛋白在EC中表達。補充圖3d中的ELISA結(jié)果顯示，EC培養(yǎng)消耗了部分配體分子，F(xiàn)B培養(yǎng)增大了大部分因子的濃度。以上一系列實驗結(jié)果都證實了CellChat的預(yù)測的特定細胞類型中的關(guān)鍵配體-受體的表達模式。隨后作者評估了這些信號配體對EC功能的影響，結(jié)果是IGF1和SCF信號對CC組織修復(fù)相關(guān)功能具有正向調(diào)節(jié)作用，IGF1、SCF、FGF7和HBEGF信號有利于平滑肌舒張調(diào)節(jié)功能，而高濃度的AGEs和TGFβ則對這些功能不利。這些信號網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果有助于進一步理解海綿體微環(huán)境的生理和病理過程。

編者心得二：細胞通訊分析的驗證實驗

細胞通訊網(wǎng)絡(luò)分析，屬于單細胞數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性分析。如果以身邊發(fā)生的事情舉例子，最近你如果正考慮買房/租房，那大概率會被各種房屋中介銷售打來的詢問電話折磨的苦不堪言。如果你家有小孩子，那很可能會遭受到各種教育培訓(xùn)機構(gòu)推銷電話的輪番轟炸。因此如果歸納出房屋中介銷售/教育培訓(xùn)機構(gòu)頻繁聯(lián)系的群體，那這個群體極有可能是對應(yīng)的受眾群體。

細胞通訊網(wǎng)絡(luò)分析做的正是這樣的工作：相當于將某個區(qū)域內(nèi)所有細胞（人）的通話記錄加以歸類和統(tǒng)計，并通過整個通訊網(wǎng)絡(luò)，總結(jié)出信息流的來龍去脈與層級結(jié)構(gòu)，并進而根據(jù)各種通訊的屬性/功能來推斷不同細胞（人）群體之間發(fā)生的互動。

細胞通訊分析雖好，仍然屬于一種推斷分析，即根據(jù)配體-受體表達分布和細胞類型來推斷可能的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。因此嚴謹而系統(tǒng)的細胞功能學(xué)實驗是越來越得到重視的驗證手段。如何設(shè)計驗證實驗，作者在文章中做出了很好的示范，下面奉上編者總結(jié)歸納的細胞通訊分析的驗證實驗：

???驗證方法1：檢測配體/受體的mRNA表達水平

因為單細胞測序通常檢測的是mRNA表達水平，因此利用RNA-seq或者qPCR來驗證對應(yīng)的細胞類型中，是否表達了大量的配體或受體的mRNA分子，也是十分合理的。并且由于都是檢測mRNA的表達水平，驗證結(jié)果有更大可能與單細胞測序的分析結(jié)果取得一致。

???驗證方法2：檢測配體/受體的蛋白表達水平

也可以考慮用抗原特異性的抗體，通過免疫組化染色（IHC）、免疫熒光染色（ICC）或者流式細胞術(shù)（FACS）等技術(shù)手段，檢測對應(yīng)的細胞類型中，是否有高水平的配體或受體蛋白分子。但由于mRNA轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的表達往往具有不一致性，也存在無法得到一致的驗證結(jié)果的風(fēng)險。

???驗證方法3：檢測配體/受體的功能性吸收與釋放

前兩種方法都是檢測目的mRNA或目的蛋白表達的有無或高低，屬于靜態(tài)的檢測。而如果提取對應(yīng)的細胞進行培養(yǎng)，并用ELISA檢測培養(yǎng)上清中，是否對應(yīng)的配體蛋白濃度由于新釋放或者被吸收發(fā)生了動態(tài)改變，則是一種更可信的驗證手段。這篇文章的作者就利用了這個方法，成功驗證了成纖維細胞（FB）釋放相關(guān)配體以及血管內(nèi)皮細胞（EC）吸收相關(guān)配體的現(xiàn)象。