前言??

人類真皮成纖維細(xì)胞是皮膚的細(xì)胞成分，由于自身特性表現(xiàn)出細(xì)胞間的表型異質(zhì)形態(tài)。單個(gè)真皮成纖維細(xì)胞可以有不同的細(xì)胞特性，負(fù)責(zé)傷口修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)改變、纖維化或重塑等功能。而不同表型的成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)代謝及脂質(zhì)成分是否參與成纖維細(xì)胞亞型的建立尚不清楚。研究真皮成纖維細(xì)胞的總體脂質(zhì)組成和表型狀態(tài)，以尋找脂質(zhì)在確定真皮成纖維細(xì)胞身份中的可能作用是尚待解決的難題。

本篇由瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院Gioele La Manno和Giovanni D’Angelo教授/課題組在Science期刊發(fā)表的題為 “Sphingolipids control dermal fibroblast heterogeneity?”（IF：63.714）的研究成果，通過(guò)高分辨率質(zhì)譜成像、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、RNA測(cè)序技術(shù)等研究方法，以人真皮成纖維細(xì)胞（dHFs）為研究的對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了人真皮成纖維細(xì)胞（dHFs）的特征，探究了真皮成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性機(jī)理，描繪了真皮成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)和轉(zhuǎn)錄圖譜。為研究真皮成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)組成、轉(zhuǎn)錄和表型狀態(tài)提供了理論依據(jù)。

研究思路

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組/研究材料

原代真皮人成纖維細(xì)胞（dHFs）

2. 技術(shù)路線

2.1?空間代謝組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)：分析人成纖維細(xì)胞

2.2 ESI-LC/MS和MRM：生成dHFs質(zhì)譜圖像、評(píng)估脂質(zhì)變異性、單像素分析

2.3 scRNA-seq：dHFs ?RNA測(cè)序

3. 統(tǒng)計(jì)分析

PCA分析、皮爾遜相關(guān)系數(shù)

研究結(jié)果

1.?空間代謝組學(xué)揭示了脂質(zhì)異質(zhì)性的組織原理

原代真皮人成纖維細(xì)胞（dHFs）進(jìn)行空間代謝組學(xué)分析（圖1A），從原始數(shù)據(jù)中提取脂質(zhì)圖像。通過(guò)電噴霧電離液相色譜-質(zhì)譜（ESI-LC）和基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），可獲得脂質(zhì)圖像（圖1A-B）。主成分分析（PCA）描繪了不同脂質(zhì)組的不同分布模式（圖1C）。部分僅顯示正像素或負(fù)像素，與PC1、PC2至PC8的觀察結(jié)果相反，屬于鞘脂途徑的脂質(zhì)（圖1D）。dHFs中存在兩個(gè)共存的脂質(zhì)變化軸，一個(gè)軸與細(xì)胞內(nèi)組織有關(guān)，另一個(gè)軸則與脂質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞間異質(zhì)性有關(guān)。

圖1 | dHFs的單像素空間代謝組學(xué)分析

2.?單細(xì)胞分析揭示脂質(zhì)協(xié)同調(diào)節(jié)

光學(xué)圖像指導(dǎo)細(xì)胞分割，轉(zhuǎn)移到MS圖像上，可獲得三個(gè)獨(dú)立高分辨率質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)記錄的257個(gè)單細(xì)胞脂質(zhì)（圖2A）。通過(guò)計(jì)算變異系數(shù)（CV），總結(jié)整個(gè)細(xì)胞群中與單個(gè)脂質(zhì)種類相關(guān)的細(xì)胞間變異性，鞘脂途徑具有較高的細(xì)胞間變異性（圖2B）。脂質(zhì)-脂質(zhì)相關(guān)性（皮爾遜R）矩陣，測(cè)試鞘脂代謝途徑是否被協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)，或在不同細(xì)胞中不同的鞘脂亞群是否被獨(dú)立控制（圖2C）。單細(xì)胞脂質(zhì)體根據(jù)脂質(zhì)組成，形成不同的細(xì)胞簇，并觀察到某些物種（即Cers、HexCers、Gb3s和Gb4s）在特定細(xì)胞簇中富集，表明dHFs存在于不同的鞘脂代謝狀態(tài)中（圖2D-F）。

圖2?|?單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析

3.?鞘磷脂定義dHFs脂肪類型

采用熒光標(biāo)記的細(xì)菌毒素可識(shí)別不同的鞘脂頭基。毒素染色的dHFs可由空間代謝組學(xué)觀察到（圖3A），通過(guò)空間質(zhì)譜成像技術(shù)，ShTxB1a染色與Gb3水平相關(guān)性最好，ShTxB2e染色與Gb4和Gb3水平相關(guān)良好（圖3B）。分析四個(gè)不相關(guān)的dHFs，表現(xiàn)出類似的細(xì)胞間鞘脂變異模式，表明細(xì)菌毒素捕獲細(xì)胞間鞘磷脂的異質(zhì)性，且不同個(gè)體的dHFs也存在鞘脂異質(zhì)性。dHFs存在于不同的脂質(zhì)代謝構(gòu)型中，并涉及細(xì)胞大小、不同細(xì)胞表型形狀及不同的內(nèi)吞和分泌狀態(tài)（圖3C-D）。

作者通過(guò)模型預(yù)測(cè)ShTxB1a+/2e+、ChTxB+和triple+細(xì)胞在單細(xì)胞復(fù)制周期（21小時(shí)）中，分別有37%、51%和68%的概率轉(zhuǎn)化為不同的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖3E-G）。實(shí)驗(yàn)證明，ShtxB1a+和ShtxB2e+狀態(tài)則更為短暫，并顯示出轉(zhuǎn)化為ShtxB1a的更大傾向（圖3J）。FACS選擇ShTxB1a+或ChTxB+細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)物恢復(fù)為具有與最初選擇細(xì)胞相似的脂質(zhì)狀態(tài)組成的異質(zhì)細(xì)胞群（圖3K）?；谶@些結(jié)果，表明dHFs存在于亞穩(wěn)態(tài)鞘脂代謝構(gòu)型中（圖3L），并在細(xì)胞世代中持續(xù)存在。

圖3?|?空間代謝組和毒素染色鑒定dHF脂肪類型

4.?脂質(zhì)類型標(biāo)記特定的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序dHFs，識(shí)別了17個(gè)細(xì)胞簇（圖4A）。這17個(gè)集群被分為六類：增殖、促炎細(xì)胞因子分泌（炎癥）、促纖維化分泌（纖維化）、細(xì)胞外基質(zhì)重塑（纖維化）和促血管生成因子分泌（血管）（圖4B），炎癥、纖維化和纖維化分別代表相互替代的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞配置（圖4C-D）。

FACS根據(jù)dHFs的脂肪類型分離dHFs，并分離出ChTxB+、ShTxB2e+、ShTxB1a+/2e+和triple+細(xì)胞（圖4E）。不同脂肪類型的高表達(dá)映射到不同區(qū)域（圖4F-G），triple+細(xì)胞對(duì)應(yīng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的炎癥、纖維溶解性和血管成纖維細(xì)胞，表明特定的脂肪類型與普遍細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)（圖4H）。將dHFs與不同簇的毒素和標(biāo)記物進(jìn)行比較，顯示ChTxB和平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞之間、ShTxB2e和層粘連蛋白a陽(yáng)性細(xì)胞之間存在特定的重疊。說(shuō)明，脂肪類型是dHFs細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)志物（圖4I-J）。

圖4?| 脂肪類型映射轉(zhuǎn)錄細(xì)胞的狀態(tài)

5. 脂質(zhì)類型標(biāo)記體內(nèi)特定dHF群體

真皮深層區(qū)域的成纖維細(xì)胞具有成纖維活性，乳頭狀成纖維細(xì)胞具有更大的增殖能力。兩者的dHFs的轉(zhuǎn)錄特征映射到UMAP，并有區(qū)域重疊現(xiàn)象（圖5-B）。ChTxB+細(xì)胞出現(xiàn)在網(wǎng)狀真皮區(qū)域，ShTxB1a+/2e+細(xì)胞主要出現(xiàn)在乳頭狀真皮區(qū)域（圖5C）。成纖維細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和其他真皮標(biāo)志物的染色證實(shí)，dHFs被毒素染色后具有不同的特異性（圖5D）。

皮膚受損時(shí)，如受傷或癌癥損傷，皮膚成纖維細(xì)胞被激活并經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)換，表明ChTxB+細(xì)胞是癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAF）（圖5F）。CAF主要是ChTxB+和ShTxB1a–/2e–（圖5G-H），dHFs脂肪類型由分布在不同皮膚區(qū)域的成纖維細(xì)胞亞型反映，與皮膚癌有不同的關(guān)聯(lián)。

圖5?|?脂質(zhì)類型定義皮膚中的dHFs群體

6. 鞘磷脂成分影響細(xì)胞狀態(tài)

單細(xì)胞鞘脂組成由轉(zhuǎn)錄后的機(jī)制決定。脂質(zhì)類型與細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)，但細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有賦予轉(zhuǎn)錄程序，不能解釋脂肪類型。通過(guò)Cer合成酶抑制劑FB1治療dHFs，會(huì)阻斷鞘脂的產(chǎn)生。當(dāng)FB1處理的dHFs與對(duì)照細(xì)胞整合在相同的轉(zhuǎn)錄嵌入中時(shí)，表現(xiàn)出不同的分布狀態(tài)（圖6C）。FB1治療剝奪了細(xì)胞的鞘脂，通過(guò)表達(dá)（OE）細(xì)胞顯示鞘脂組成的預(yù)期變化，GM3S-OE dHFs主要由ChTxB+細(xì)胞組成，Gb4S OE dHFs主要由ShTxB1a+/2e+細(xì)胞組成（圖6E）。scRNA-seq分析GM3S-OE和Gb4S OE系，測(cè)試脂質(zhì)類型變化對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。Gb4S OE細(xì)胞顯著下調(diào)，纖維溶解和炎癥標(biāo)記物MMP-1和CCL2在Gb4S OE細(xì)胞中上調(diào)，GM3S-OE細(xì)胞下調(diào)（圖6 F- G）。

圖6?|?鞘脂擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響

7.?鞘脂整合到調(diào)節(jié)回路中參與細(xì)胞狀態(tài)測(cè)定

FB1引發(fā)的轉(zhuǎn)錄變化涉及FGF2激活和TGF-b靶點(diǎn)的抑制。TGF-b上調(diào)基因，TGF-b下調(diào)基因。FGF2在對(duì)照細(xì)胞和成纖維細(xì)胞群中有更多表達(dá)。dHFs受到FGF2或TGF-b攻擊時(shí)，鞘脂耗竭不會(huì)抑制成纖維細(xì)胞對(duì)TGF-b的反應(yīng)，而會(huì)增加細(xì)胞對(duì)FGF2的敏感。此外，F(xiàn)GF遺傳信號(hào)中斷通過(guò)DNFGFR1表達(dá)，并顯著減弱對(duì)FB1的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖7A-C），表明鞘脂誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化需要FGF信號(hào)。

轉(zhuǎn)錄反應(yīng)細(xì)胞鞘脂組成的變化也需要FGF信號(hào)（圖7D-E）。暴露在Gb3和Gb4的dHFs比暴露在GM1的dHFs更容易受到FGF通路激活的影響（圖7G）。鞘脂可調(diào)節(jié)FGF2信號(hào)，F(xiàn)GF2信號(hào)通過(guò)維持替代代謝途徑來(lái)對(duì)抗GM1的產(chǎn)生，而促進(jìn)Gb3和Gb4的產(chǎn)生（圖7H-I）。

圖7?|?鞘脂擾動(dòng)對(duì)FGF信號(hào)的影響

研究結(jié)論

文章探究了真皮成纖維細(xì)胞（dHFs）的異質(zhì)性，研究脂質(zhì)代謝的細(xì)胞身份?？紤]到脂質(zhì)的普遍存在及其結(jié)構(gòu)多樣性，期待發(fā)現(xiàn)其他的細(xì)胞類型。研究的一個(gè)局限性是是無(wú)法處理脂質(zhì)和轉(zhuǎn)錄軌跡的活細(xì)胞和單細(xì)胞。時(shí)間分辨數(shù)據(jù)，可能闡明脂質(zhì)代謝通量在單元狀態(tài)轉(zhuǎn)變期間的演變。通過(guò)高分辨率質(zhì)譜成像技術(shù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，細(xì)胞間的異質(zhì)性脂質(zhì)代謝在多細(xì)胞系統(tǒng)的自組織中具有指導(dǎo)作用。

研究通過(guò)單個(gè)細(xì)胞的脂質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在確定細(xì)胞狀態(tài)中起著驅(qū)動(dòng)作用。特定的脂肪類型影響了信號(hào)受體的活性，脂質(zhì)重塑可能在早期建立了細(xì)胞身份的驅(qū)動(dòng)因素，及跟蹤單個(gè)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝軌跡。研究激發(fā)了關(guān)于脂質(zhì)在細(xì)胞中的新問(wèn)題，探尋脂質(zhì)在決定真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞身份方面可能發(fā)揮的作用，并為多細(xì)胞系統(tǒng)增加了新的調(diào)控成分。

小鹿推薦

本文通過(guò)將高分辨率質(zhì)譜成像技術(shù)-空間代謝組學(xué)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的方法，測(cè)量了人真皮成纖維細(xì)胞（dHFs）的脂質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組。發(fā)現(xiàn)特定脂質(zhì)代謝途徑的細(xì)胞間變化，有助于與皮膚結(jié)構(gòu)組織相關(guān)細(xì)胞狀態(tài)的建立，并揭示了一種新的多細(xì)胞系統(tǒng)自組織調(diào)節(jié)成分。

AFADESI-MSI空間代謝組技術(shù)，可檢測(cè)空間分辨率包括100um*100um、40um*40um等多種空間分辨率。已建立多種腦、心、肝等多種組學(xué)的空間代謝組自建數(shù)據(jù)庫(kù)。AFADESI-MSI平臺(tái)不涉及基質(zhì)噴涂，定性到的物質(zhì)中30%為脂質(zhì)，70%為700Da或者500Da以下的小分子物質(zhì)，可更均衡地涵蓋1000Da以下的小分子物質(zhì)。

基于AFADESI平臺(tái)發(fā)表的方法學(xué)及應(yīng)用文章目前已在Gut、PNAS、Theranostics、Advanced Science、Analytical chemistry、Analytica Chimica Acta等期刊上發(fā)表相關(guān)文章10+篇。

詳細(xì)技術(shù)請(qǐng)?jiān)L問(wèn)鹿明生物官網(wǎng)

?

百度搜索鹿明生物（lumingbio）

?

了解更多多組學(xué)技術(shù)

（AFADESI-MSI空間代謝組技術(shù)、質(zhì)譜成像）

猜你還想看

1. 項(xiàng)目文章 | 蛋白質(zhì)組+代謝組學(xué)的多組學(xué)技術(shù)探究蘋果“糖心”的秘密

2. ? 完美落幕~鹿明生物蛋白代謝2022年12月35篇項(xiàng)目文章發(fā)表，平均IF:7.72!
   

3. ? 開年喜報(bào) | 恭喜賀玖明、呂海濤研究員入選《藥學(xué)學(xué)報(bào)》英文刊（APSB）2022年度優(yōu)秀青年編委

4. ??2022 鹿明年度報(bào)告，一起揭曉「我的答案自白」~

本文系鹿明生物原創(chuàng)

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明本文轉(zhuǎn)自鹿明生物