上期CRISPR系統(tǒng)專題內(nèi)容重點(diǎn)介紹了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)和細(xì)胞同源重組修復(fù)機(jī)制（HDR）的基因編輯技術(shù)，該技術(shù)可以通過不同的Donor模板實(shí)現(xiàn)基因組點(diǎn)突變、大片段敲入，在基因點(diǎn)突變遺傳病研究方向展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但該技術(shù)也存在同源重組效率不高、容易出現(xiàn)非同源重組產(chǎn)生不可預(yù)知的突變類型等問題，自此更簡便、高效且精準(zhǔn)的單堿基編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，今日小恒便給大家盤點(diǎn)一下單堿基編輯器的種類及相應(yīng)工作原理。目前開發(fā)的單堿基編輯系統(tǒng)主要包括胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）、鳥嘌呤堿基編輯器（GBE）和先導(dǎo)編輯器（Prime Editor）。

?

胞嘧啶堿基編輯器（CBE）[1]

CBE的核心組成元件是nCas9或dCas9和胞嘧啶脫氨酶，Cas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶組成融合蛋白。具體工作原理：當(dāng)融合蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下靶向基因組DNA時(shí)，胞嘧啶脫氨酶可結(jié)合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因組DNA形成的R-loop區(qū)的ssDNA處，將該ssDNA上一定范圍內(nèi)的胞嘧啶(C)脫氨變成尿嘧啶(U)，進(jìn)而通過DNA復(fù)制或修復(fù)將U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），最終實(shí)現(xiàn)C/G堿基對(duì)至T/A堿基對(duì)的直接替換。由David Liu實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的CBE經(jīng)歷了四代升級(jí)，第四代胞嘧啶堿基編輯器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI包含了大鼠的胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1），突變的Cas9（D10A）—nCas9以及兩個(gè)尿嘧啶糖基化酶抑制子，實(shí)現(xiàn)了編輯效率及精準(zhǔn)度的不斷提升。

圖1 CBE工作原理圖（Komor AC et al, 2016）

?

腺嘌呤堿基編輯器（ABE）[2]

與CBE類似，ABE的融合蛋白由nCas9（D10A）和以大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶TadA為基礎(chǔ)人為定向改造而來的腺嘌呤脫氨酶組成。在sgRNA的引導(dǎo)下，融合蛋白靶向基因組DNA時(shí)，腺嘌呤脫氨酶結(jié)合至ssDNA上，將一定范圍內(nèi)的A脫氨替換為次黃嘌呤(I)，而I在DNA水平會(huì)被作為G進(jìn)行讀碼與復(fù)制，最終實(shí)現(xiàn)A/T堿基對(duì)至G/C堿基對(duì)的直接替換。ABE7.10（ecTadA-ecTadA*-nCas9）是目前效率最高且應(yīng)用最廣的ABE版本，將nCas9與野生型腺嘌呤脫氨酶ecTadA和經(jīng)過定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶ecTadA*二聚體融合，在人類細(xì)胞中編輯效率約為50%，編輯活性窗口可覆蓋sgRNA的第4~9位?？杀ＷC高精度的堿基替換和較少的插入突變發(fā)生，ABE的優(yōu)化方向主要為提高編輯效率、擴(kuò)大編輯活性窗口和擴(kuò)大編輯范圍。

?

圖2 ABE工作原理圖（Gaudelli NM et al, 2017）

?

鳥嘌呤堿基編輯器（GBE）[3, 4]

GBE由胞嘧啶脫氨酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)及nCas9融合組成。在sgRNA的引導(dǎo)下，胞嘧啶脫氨酶將靶標(biāo)C轉(zhuǎn)化為U→UNG從DNA中消除U并產(chǎn)生無嘌呤/無嘧啶(AP)位點(diǎn)→AP位點(diǎn)的創(chuàng)建，再加上nCas9在DNA非編輯鏈上的切口，啟動(dòng)DNA修復(fù)和復(fù)制→導(dǎo)致G在AP位點(diǎn)的有利插入（具體機(jī)制尚未被解析），最終導(dǎo)致了C到G的編輯結(jié)果[3]。除了通過引入U(xiǎn)NG以消除U外，通過在APOBEC1-nCas9的C末端融合了一種堿基切除修復(fù)(BER)蛋白-XRCC1，可構(gòu)建另外一種GBE。一旦APOBEC1誘導(dǎo)DNA序列中C到U的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞內(nèi)源性UNG蛋白便通過去除U創(chuàng)以建一個(gè)AP位點(diǎn)，之后XRCC1通過招募其他BER蛋白來修復(fù)AP位點(diǎn)，導(dǎo)致G成為主要的修復(fù)產(chǎn)物[4]。

圖3 GBE工作原理圖（Molla KA et al, 2020）

先導(dǎo)編輯器（PE）[5]

PE系統(tǒng)同樣以CRISPR-Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)，包括pegRNA（Prime Editing Guide RNA）和融合蛋白兩個(gè)核心部分：pegRNA是在sgRNA的基礎(chǔ)上，在其3’末端增加了一段RNA序列，這段序列具有雙重角色，一端作為逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合位點(diǎn)（Primer Binding Site，PBS），另一端則是能與逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄模板（Reverse Transcriptase Templates，RTT），攜帶著設(shè)計(jì)的目標(biāo)點(diǎn)突變或插入缺失突變；融合蛋白是將nCas9（H840A突變型，只切斷含PAM的靶點(diǎn)DNA鏈）與逆轉(zhuǎn)錄酶融合獲得的新型蛋白。

PE工作原理：在pegRNA的引導(dǎo)下，nCas9切斷含PAM的靶點(diǎn)DNA鏈，斷裂的靶DNA鏈與pegRNA的3’末端PBS序列互補(bǔ)并結(jié)合，之后逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮功能，沿RT模板序列開始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后DNA鏈的切口處會(huì)形成處在動(dòng)態(tài)平衡的不成雙鏈的5’-flap和3’-flap結(jié)構(gòu)，其中3’-flap結(jié)構(gòu)的DNA鏈攜帶有目標(biāo)突變，而5’-flap結(jié)構(gòu)的DNA鏈則無任何突變。細(xì)胞內(nèi)5’-flap結(jié)構(gòu)易被結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶識(shí)別并切除，之后經(jīng)DNA連接和修復(fù)后靶位點(diǎn)處便實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的基因編輯。

圖4 PE工作原理圖（Anzalone AV et al, 2019）

?

單核苷酸突變是大約2/3人類遺傳病發(fā)生的原因，也是許多動(dòng)植物重要性狀變異的遺傳基礎(chǔ)。單堿基編輯技術(shù)基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在不產(chǎn)生雙鏈斷裂的前提下，對(duì)DNA的單個(gè)堿基進(jìn)行替換，從而達(dá)到基因組位點(diǎn)矯正的效果。因?yàn)椴划a(chǎn)生DSB現(xiàn)象，故此出現(xiàn)堿基插入、缺失或移碼等非目標(biāo)突變的情況會(huì)大大降低，因而具備高效且精準(zhǔn)的基因編輯能力，對(duì)于單堿基突變導(dǎo)致的疾病具有重大意義。漢恒專營工具病毒十余載，可定制用于基因敲入的質(zhì)粒以及病毒工具等產(chǎn)品，如有技術(shù)問題或產(chǎn)品訂購需求，歡迎隨時(shí)咨詢！

?

參考文獻(xiàn)：

[1]?Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4.

[2]?Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471.

[3]?Zhao D, Li J, Li S, Xin X, Hu M, Price MA, Rosser SJ, Bi C, Zhang X. Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes. Nat Biotechnol. 2021 Jan;39(1):35-40.

[4]?Chen L, Park JE, Paa P, Rajakumar PD, Prekop HT, Chew YT, Manivannan SN, Chew WL. Programmable C:G to G:C genome editing with CRISPR-Cas9-directed base excision repair proteins. Nat Commun. 2021 Mar 2;12(1):1384.

[5]?Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, Liu DR. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019 Dec;576(7785):149-157.

[6]?Molla KA, Qi Y, Karmakar S, Baig MJ. Base Editing Landscape Extends to Perform Transversion Mutation. Trends Genet. 2020 Dec;36(12):899-901.