此方法適用于菌種的中長期保藏，保藏時間可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很難定量，因此一般將甘油和生理鹽水按1:1的比例配成終濃度為50%的甘油溶液。使用時，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油終濃度在20-30%即可，甘油濃度過高或過低都不利于菌種保藏。將甘油菌種轉移至-80℃冰箱長期凍存。需要取用菌種的時候，將凍存管放在37℃水浴中快速解凍，直到菌種完全融化，此時可取出菌種進行實驗。

或者配制成75%的甘油，按照1ml的體積，250ul的甘油+750ul的菌液；最終所得甘油濃度為25%。