目前做穩(wěn)定表達細胞株或者過表達細胞株是基因研究的常用技術(shù)方法，同時使用RNA干擾的技術(shù)也是通過穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的技術(shù)來實現(xiàn)，是目前細胞基因研究最常見和最普遍的技術(shù)流程。

我們可以對病毒構(gòu)建細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株大致的流程分為：

1、載體構(gòu)建（過表達載體/干擾載體）；

2、病毒包裝（慢病毒、腺病毒或者是體內(nèi)使用的AAV）；

3、細胞轉(zhuǎn)染（就是將病毒感染染目的細胞）

4、藥物篩選獲得感染細胞純度的提升；

5、蛋白或者基因功能研究；

其中的很多過程都是比較熟悉的，而目前這個技術(shù)的主要問題“難點”在于：

1、病毒對于懸浮和敏感細胞不適用；（很多懸浮細胞對病毒轉(zhuǎn)染效果不佳，或者是操作困難，例如：K562、U937等血液和懸浮細胞系；還有就是對病毒極度敏感的細胞，導(dǎo)致細胞死亡，例如：BV2、神經(jīng)元等神經(jīng)系統(tǒng)的細胞系）

2、病毒法對于基因過表達的穩(wěn)定性極限；（由于基因是通過病毒載體隨機插入到目的細胞的基因組中，所有并不是穩(wěn)定的拷貝數(shù)也不是均勻的分布，可以在后續(xù)的細胞傳代中，拷貝數(shù)會不斷稀釋，導(dǎo)致“基因表達量”逐步的下降，特別是在傳代超過15代之后，更是如此，此事加藥物也不一定能夠穩(wěn)定表達）

3、病毒法的安全性和成本高；（病毒的操作過程成本較高，一般需要幾千元的病毒包裝費用，而且都需要2-3周的時間），同時由于病毒的HIV改造特征，對人體的表皮細胞也有一定的感染性，所以需要在生物安全二級實驗室操作；

4、病毒的MOI優(yōu)化和儲存活性問題；（不同的批次的MOI是有差異的，所以每次實驗都需要對病毒的MOI進行測試并獲得最優(yōu)的MOI數(shù)據(jù)，費事費力；其次，病毒在-80度，超過2周就可以檢測到滴度的下降；）

而如何獲得穩(wěn)定的細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)而且是更加穩(wěn)定的細胞株就一直是海星生物技術(shù)團隊思考的問題！這個也是整個基因治療領(lǐng)域思考的問題。經(jīng)過了3年的技術(shù)研發(fā)，我們終于找到了一種“老”技術(shù)在應(yīng)用上的“新”生命。

VIRUS-Free技術(shù)：

VIRUS-Free 是一種利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進行細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建和篩選的技術(shù)，以替代慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的技術(shù)。其載體中包括了轉(zhuǎn)座子的識別區(qū)域，在轉(zhuǎn)座酶的催化下，將目的片段從載體上或者BAC分子上切割下來形成一個小環(huán)結(jié)構(gòu)，并在基因組里面的固定序列位置進行插入，從而實現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)。目前已經(jīng)在CAR-T細胞治療中得到較多的臨床應(yīng)用，并充分體現(xiàn)出其：低成本、高效率、基因表達穩(wěn)定的特點。

技術(shù)優(yōu)勢：

1.序列完整性好，如果小環(huán)的結(jié)構(gòu)被破壞則無法實現(xiàn)基因組插入；

2.可插入大片段，可以實現(xiàn)上百Kb的BAC片段的插入，而且能夠保證其序列完整性，可以進行復(fù)雜的基因功能研究；

3.目的插入效率高，由于通過酶促反應(yīng)，所以整個反應(yīng)的過程效率遠遠高于DNA隨機插入效率；

4.目的基因表達穩(wěn)定，由于細胞插入的拷貝數(shù)相對于病毒來說比較穩(wěn)定，在穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建過程中，細胞的表達更加穩(wěn)定；

5.實驗時間只需要慢病毒系統(tǒng)時間一半，實驗更加安全；

6.可以實現(xiàn)：穩(wěn)轉(zhuǎn)之后對目的克隆進行檢測后可以再將目的基因在原克隆移除，輕松實現(xiàn)加減法的對照。

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