“透明”的道路——光透明技術(shù)與神經(jīng)科學(xué)
撰文丨之憫（華中科技大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程博士）
責(zé)編丨高陽
排版丨小箱子
著名的恐怖電影《透明人》給不少人留下了深刻的印象，拋開科幻電影，現(xiàn)實(shí)中真的存在使生命體變透明的技術(shù)嗎？答案是肯定的，近年來發(fā)展出了能夠使離體組織和大小鼠全身透明的光透明技術(shù)，使科幻電影中的“透明”生物成為可能。光透明技術(shù)，顧名思義，就是通過多種物理化學(xué)手段，減小組織對(duì)光的散射，使不透明的生物組織變透明。該技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)、光學(xué)成像技術(shù)結(jié)合，能夠獲取完整組織的三維整體結(jié)構(gòu)信息，這樣的技術(shù)是不是非常奇妙？
光透明技術(shù)是如何實(shí)現(xiàn)的？
光透明是如何讓生物組織透明的呢？要理解這個(gè)問題，就需要先知道組織為什么不透明。生物組織成分復(fù)雜，像蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素這些物質(zhì)，對(duì)光穿透組織非常不友好。光透明技術(shù)就是使用物理和化學(xué)手段將這些物質(zhì)除去，同時(shí)將組織浸泡在折射率匹配的高滲透高折射率的試劑中（圖1），通過這樣的處理，組織就會(huì)變得透明，給光穿透組織大開方便之門。
光透明技術(shù)簡(jiǎn)介
現(xiàn)代光透明技術(shù)的研究，其實(shí)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)處于停滯的狀態(tài)。人們對(duì)生命奧秘的探索隨著認(rèn)知的加深越發(fā)的全面。從局部到整體，人們意識(shí)到三維成像的重要性，而這一迫切的需求使得光透明技術(shù)在近十年的時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)出井噴式發(fā)展。光透明技術(shù)的蓬勃發(fā)展如同春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期的“百家爭(zhēng)鳴”，各種不同的透明試劑和方法提供給科研工作者多種選擇。光透明技術(shù)方法及所用試劑種類繁多，我們可以將其歸類為脂溶性光透明技術(shù)、水溶性試劑透明技術(shù)和水凝膠包埋透明技術(shù)。
脂溶性光透明技術(shù)從原理上來講，將脂溶性的試劑引入組織中，達(dá)到透明效果。一般而言，生物組織都含有大量的水分，需要先用“油水互融”試劑作為媒介，除去水分，然后再引入脂溶性的試劑。乙醇和有機(jī)試劑BABB就是最早選出來的“黃金搭檔”。水溶性光透明技術(shù)的發(fā)展充滿了偶然性和戲劇性。Miyawaki團(tuán)隊(duì)將新生的小鼠胚胎放入尿素中，意外發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎完全透明了（圖2），據(jù)此該課題組建立了以尿素為基礎(chǔ)的Scale透明方法。后續(xù)根據(jù)尿素透明的原理，建立了一系列相關(guān)的水溶性試劑透明方法。水凝膠包埋透明技術(shù)也是采用去除脂質(zhì)達(dá)到組織透明，與尿素被動(dòng)去除脂質(zhì)不同，該方法采用了新穎的生物材料——水凝膠（丙烯酰胺）作為組織固定和包埋的主要試劑，通過電泳主動(dòng)除去脂質(zhì)。水凝膠單體酰胺結(jié)構(gòu)好像一只只小手，能夠緊緊抓住組織中蛋白質(zhì)的小尾巴（氨基末端），再通過單體直接的交聯(lián)形成一張緊密的“蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)”，把生物組織內(nèi)部的蛋白質(zhì)牢牢的粘在“蛛網(wǎng)”上。隨后通過電泳技術(shù)和強(qiáng)離子去污劑（SDS），像洗衣服一樣，將沒有黏在“蛛網(wǎng)”上的脂質(zhì)沖洗掉，以此達(dá)到透明效果。
光透明技術(shù)的應(yīng)用
光透明的方法種類很多，目前約有二十余種，并且新的方法層出不窮，光透明技術(shù)仍在不斷發(fā)展和完善?；诠馔该鞣椒ǖ牟粩嘤楷F(xiàn)和發(fā)展，相關(guān)的應(yīng)用研究也得以快速發(fā)展。
光透明技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路的示蹤。神經(jīng)環(huán)路示蹤技術(shù)簡(jiǎn)單來說就是使用特殊的病毒特異性感染神經(jīng)元，病毒經(jīng)過研究者的改造，能夠使被感染的神經(jīng)元帶有綠色或者紅色的熒光。通過這種顏色的顯示，我們能夠看到不同腦區(qū)神經(jīng)元及其纖維的投射情況，以及它們又是如何連接在一起的。以u(píng)DISCO（ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs）為例，聯(lián)合病毒示蹤技術(shù)可以幫助我們理解神秘莫測(cè)的神經(jīng)環(huán)路（圖3）。圖中綠色和紫紅色是被病毒（AAV-GFP/RFP）標(biāo)記的皮層神經(jīng)元。我們能通過重建的三維圖，清晰看到皮層神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維延伸到脊髓末端。像這樣長(zhǎng)距離的投射在神經(jīng)系統(tǒng)里比較常見，如果采用傳統(tǒng)切片染色的方法，我們很難清晰直觀地看到如此長(zhǎng)的神經(jīng)投射。而光透明技術(shù)的出現(xiàn)，就像將圖片變成動(dòng)畫片一樣，可以呈現(xiàn)出一個(gè)生動(dòng)活潑的影像。除應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路研究，光透明方法也常用于觀察胚胎的發(fā)育過程。如圖4所示，利用光透明技術(shù)可觀察孕14.5天的胎鼠全身神經(jīng)絲，這樣色彩鮮亮美麗的三維圖，是不是很好地勾勒了胚胎發(fā)育的神奇和夢(mèng)幻呢？
此外，光透明技術(shù)在心腦血管研究中也起到了重要的推動(dòng)作用。腦外傷或腦血管病造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷對(duì)身體健康帶來極大影響，甚至?xí)＜吧?，是人們一直以來談虎色變的話題。以往由于方法的限制，多數(shù)研究都有“頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳”的局限，很少能夠觀察到模型動(dòng)物的病理改變的全貌，對(duì)于其伴發(fā)外周癥狀的認(rèn)識(shí)仍存在局限。vDISCO（nanobody(VHH)-boosted 3D imaging of solvent-cleared organs）技術(shù)的出現(xiàn)打破了這樣的僵局，該技術(shù)被美國(guó)國(guó)立精神衛(wèi)生研究所所長(zhǎng)Thomas Insel評(píng)價(jià)為“這可能是幾十年來神經(jīng)解剖學(xué)最重要的進(jìn)展之一”。vDISCO技術(shù)在對(duì)小鼠進(jìn)行透明化處理后，利用納米抗體選擇性對(duì)特定的細(xì)胞類型進(jìn)行標(biāo)記。在不破壞機(jī)體結(jié)構(gòu)的情況下，不僅可以將小鼠體內(nèi)不同類型細(xì)胞的互作關(guān)系清晰準(zhǔn)確地呈現(xiàn)出來，而且可以真正“透視”小鼠細(xì)胞、組織及器官的狀態(tài)以及之間的聯(lián)系。針對(duì)于腦損傷后引起或伴發(fā)肢體癥狀，研究者使用vDISCO透明技術(shù)，從腦損傷造模后的小鼠獲取了全身三維圖像，有助于直接觀察研究腦損傷后引起肢體動(dòng)作不靈活的神經(jīng)機(jī)制。從圖5中我們能夠看到，與未經(jīng)受腦損傷的小鼠相比，腦損傷后小鼠上肢神經(jīng)叢數(shù)量明顯降低。這種全身透明技術(shù)，展示了病理狀態(tài)下，器官之間神秘的互相影響，為未來治療創(chuàng)傷性腦損傷提供新的思路。
綜上所述，處于不斷發(fā)展和完善的光透明技術(shù)，在神經(jīng)環(huán)路示蹤、胚胎發(fā)育以及神經(jīng)疾病研究中已經(jīng)有了較廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)透明化技術(shù)只能對(duì)軟組織進(jìn)行處理，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)軟組織和骨骼等硬組織的透明化處理，期待這一技術(shù)能夠得到進(jìn)一步發(fā)展，并憑借其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)未來在腫瘤轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞移植療效評(píng)估等領(lǐng)域得到更多應(yīng)用，幫助我們更深入地探索機(jī)體生理及疾病的奧秘。
封面來源
Zhong Hua (Johns Hopkins School of Medicine) https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2013-photomicrography-competition
參考文獻(xiàn)
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Zhu, J., et al., MACS: Rapid Aqueous Clearing System for 3D Mapping of Intact Organs. Advanced Science, 2020. 7: p. 1903185.
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