? ? ? ?今天介紹的是煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)，它是少數(shù)幾個擁有高專一性蛋白酶的病毒。

簡介

? ? ? ?煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus/TEV)是一種隸屬于馬鈴薯Y病毒(Potyvirus)的植物病毒，TEV具有單鏈正義RNA基因組，被由單一病毒編碼蛋白質(zhì)制成的衣殼包圍。病毒是長約730納米的絲狀顆粒。它通過包括桃蚜在內(nèi)的10多種蚜蟲以非持續(xù)性的方式傳播。它也很容易通過機(jī)械手段傳播，但目前還不知道通過種子傳播。

病毒宿主

? ? ? ?該病毒可感染茄科許多種植物。它侵染的重要農(nóng)業(yè)作物包括辣椒(即C. annuum與C. frutescens)、番茄(Lycopersicon esculentum)和煙草(Nicotiana spp.)。

? ? ? ?它還感染許多多年生雜草，可作為病毒庫易感的農(nóng)業(yè)作物。這些雜草種類包括龍葵(Solanum nigrum)、狗茄子(Solanum aculeatissimum)、藜(Chenopodium album)、曼陀羅(Datura stramonium)、加拿大柳藍(lán)花(Linaria canadensis)和酸漿屬(地櫻桃)。因此，控制該病毒的建議包括控制敏感茄科作物及其周圍的雜草。

癥狀表現(xiàn)

? ? ? ?感染煙草蝕紋病毒的植物的癥狀可能因植物而異。然而，典型的癥狀包括無葉脈、斑駁和壞死線或蝕刻。癥狀可能出現(xiàn)在葉子和果實上，植物可能會發(fā)育不良。

? ? ? ?以TEV為代表的馬鈴薯Y病毒家族產(chǎn)生的病毒包涵體如果染色得當(dāng)，可以在光學(xué)顯微鏡下看到。馬鈴薯Y病毒產(chǎn)生兩種可在已知宿主中診斷的內(nèi)含物。其中一個包涵體是在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的圓柱形包涵體，第二個包涵體在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)。核酸染色(天青A/Azure A)中無包涵型染色。(煙草蝕刻病毒包含在各種宿主中)

地理分布

? ? ? ?TEV似乎是一種在新大陸進(jìn)化的病毒，在加拿大、美國(包括夏威夷)、北美的墨西哥和波多黎各以及南美的委內(nèi)瑞拉都有報道。

煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶

? ? ? ?TEV蛋白酶(Tobacco Etch Virus nuclear內(nèi)含物-a 內(nèi)肽酶)是從煙草蝕刻病毒(TEV)中提取的一種高度序列特異性的半胱氨酸蛋白酶它是胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶PA族的一員。由于其高度的序列特異性，常被用于融合蛋白的體外和體內(nèi)的控制切割。

結(jié)構(gòu)

? ? ? 用X射線晶體學(xué)方法確定了TEV蛋白酶的結(jié)構(gòu)它由兩個β-桶和一條靈活的c端尾組成，與蛋白酶的糜蛋白酶超家族(PA族，MEROPS分類為C4家族)具有結(jié)構(gòu)同源性雖然與細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶，彈性蛋白酶，凝血酶等)同源，TEV蛋白酶使用半胱氨酸作為其催化親核試劑(與許多其他病毒蛋白酶一樣)。

? ? ? ?采用Asp-His-Cys三元共價催化，在兩個桶之間分裂(Asp在β1上，His和Cys在β2上)底物為β-薄片，與木桶之間的裂縫形成反平行相互作用，與c端尾部形成平行相互作用因此，酶在底物周圍形成一個結(jié)合通道，側(cè)鏈相互作用控制特異性。

專一性

? ? ? ?首選的，自然的切割序列首先通過檢查切割位點在自然多蛋白底物的重復(fù)序列確定。這些本地切割位點的共識是ENLYFQ\S，其中“\”表示分裂的肽鍵底物殘基在切前標(biāo)記為P6 - P1，切后標(biāo)記為P1’。早期的工作還測量了一系列類似底物的切割，以表征該蛋白酶對自然序列的特異性。

? ? ? 隨后的研究利用從隨機(jī)序列池中切割底物的測序來確定偏好模式。雖然ENLYFQ\S是最優(yōu)序列，但該蛋白酶在一定范圍的底物上或多或少具有活性(即顯示一些底物亂序)。最接近共識EXLYΦQ\φ的序列解理最高，其中X是任何殘基，Φ是任何大中型疏水殘基，φ是任何小型疏水或極性殘基。雖然該序列是最優(yōu)的，但如果序列的其他部分是最優(yōu)的，在某些位置殘基不利的序列仍然可以被切割。

? ? ? ?酶與底物接觸面積大，具有專一性。蛋白酶，如胰蛋白酶，由于只有一個或兩個袋結(jié)合底物側(cè)鏈的淺結(jié)合斷裂，因此對裂解鍵前后的一個殘基具有特異性。相反，病毒蛋白酶，如TEV蛋白酶，有一個長長的c端尾，它完全覆蓋底物，形成一個結(jié)合隧道。該通道包含一組緊密結(jié)合袋，使得底物肽的每一條側(cè)鏈(P6到P1′)都結(jié)合在一個互補(bǔ)位點(S6到S1′)

? ? ? 特別是肽側(cè)鏈P6-Glu連接三個氫鍵網(wǎng)絡(luò)；P5-Asn指向溶劑，沒有特定的相互作用(因此在該位置缺乏底物共識);P4-Leu被埋在疏水口袋中；P3-Tyr被固定在一個末端有短氫鍵的疏水口袋中；p2 -苯丙氨酸也被疏水分子包圍包括三聯(lián)組氨酸的表面；P1-Gln形成4個氫鍵;而P1′-Ser僅部分封閉在淺層疏水槽中。

生物技術(shù)應(yīng)用

? ? ? ?該蛋白的主要用途之一是從純化的重組融合蛋白中去除親和標(biāo)記。TEV蛋白酶作為生化工具的原因是其較高的序列特異性。當(dāng)偏好序列插入到柔性環(huán)中時，這種特異性允許控制蛋白質(zhì)的切割。這也使得它在體內(nèi)相對無毒，因為被識別的序列很少出現(xiàn)在蛋白質(zhì)中。

? ? ? ?盡管定向優(yōu)化設(shè)計在改變蛋白酶特異性方面取得了有限的成功，但定向進(jìn)化已經(jīng)被用于改變斷裂位點之前或之后的首選殘基。

? ? ? ?然而，TEV蛋白酶作為生化工具也有局限性。它容易通過自裂(自溶)而失活，盡管這種失活可以通過內(nèi)部劈裂位點的單個S219V突變來消除單獨表達(dá)的蛋白酶溶解性也很差，然而，通過定向進(jìn)化和計算設(shè)計，已經(jīng)進(jìn)行了幾次嘗試來改善其溶解性。也有研究表明，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為溶解度增強(qiáng)的伙伴，可以通過融合提高表達(dá)。

? ? ? ?據(jù)報道，TEV蛋白酶在4°C時的活性下降了10倍，在34°C以上的溫度下失去活性。這種酶的分子量在25 - 27kda之間變化，這取決于所使用的特定結(jié)構(gòu)。